Effekten av co-enzym Q10 tillsammans med fertilitetsläkemedel på graviditetsresultatet av provrörsbefruktning (CoQ10-IVF)

Syftet med denna studie är att utvärdera effektiviteten av CoQ10-administrering med avseende på dess effekt på graden av aneuploidi hos oocyter och kumulativa levande födslar.

Studiedesign Detta är en prospektiv randomiserad placebokontrollerad studie. Studiedeltagare kommer att genomgå upp till 3 cykler som en del av detta protokoll. Alla kliniska bedömningar kommer att genomföras på de deltagande infertilitetsklinikerna.

Studien kommer att organiseras på poliklinisk basis vid Toronto Center for Advanced Reproductive Technology (TCART). Studien kommer att involvera 54 kvinnor i åldern 35-43 år som genomgår IVF-behandling. Alla kvinnor kommer att samla 2 mL saliv i ett 5 mL polyetenrör för baslinjemätning av coQ10-aktivitet med arNOX-analys (beskrivs nedan).

Studiedeltagare kommer att slumpmässigt tilldelas antingen placebo- eller COQ10-kapslar, (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD-registreringskoder 135307). Studiedeltagare kommer att ta 600 mg CoQ10 oralt en gång om dagen med frukost eller identiska placebokapslar i 2 månader före en IVF-cykel och upp till 3 cykler om graviditet inte inträffar. På cykeldag 3 kommer försökspersonerna att börja stimulera äggstockarna för provrörsbefruktning samtidigt som de fortsätter att konsumera kosttillskotten. Den kontrollerade ovariestimuleringen (COH) kommer att bestå av mikrodos GnRH agonist flare protocol, som är klinikens standardprotokoll för äldre kvinnor. COH kommer att göras med användning av rekombinant FSH (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Kanada) eller humana klimakteriets gonadotropiner (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Kanada) 150 enheter två gånger dagligen S.C. och Buserelin Acetate (Superfact, Sanofi -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg subkutant B.I.D, och kommer att fortsätta till dagen före 10 000 enheter humant koriongonadotropin (hCG) (Pregnyl, Organon). Dosen kommer inte att ändras och måste bibehållas under hela studien. Båda läkemedlen fortsätter dagligen tills follikelutvecklingen anses vara tillräcklig (minst 3 folliklar >17 mm och E2-nivån är acceptabel för antalet närvarande folliklar) vid vilken tidpunkt hCG kommer att injiceras för att utlösa slutlig follikelmognad. Oocytåtervinning kommer att göras 36 timmar senare genom vaginal ultraljudsstyrd nålspiration och med användning av lokalbedövning och mild sedering. Vid tidpunkten för hämtning kommer försökspersonerna att samla in 2 ml saliv, dessutom kommer 2 ml follikelvätska att samlas upp från den första follikeln som aspireras från varje äggstock för bestämning av coQ10-aktivitet med arNOX-analys. Eftersom det inte är möjligt att mäta CoQ10-nivåer i en enda cell (t.ex. oocyter), representerar FF direkt cellulär miljö som kan återspegla denna cells metaboliska profil. Efter hämtning kommer oocyterna att befruktas med ICSI för att inte kontaminera moderns DNA under polarkroppsbiopsiprovet med spermie-DNA. Följande dag kommer alla oocyter med 2 pronuclei att genomgå en biopsi av en eller båda polära kropparna.

Polär kroppsbiopsi Oocyten insemineras sedan med tekniken intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) och förvaras i kultur i en inkubator. För att biopsi av den polära kroppen hålls oocyten av hållpipetten med den polära kroppen i positionen klockan 11-12. En öppning görs i zona pellucida och en polerad glasnål införs i perivitellina utrymmet och den polära kroppen avlägsnas försiktigt.

Embryoöverföringen utförs på morgonen den tredje dagen efter ägguttag.

Polära kroppar tvättas i droppar av isoton HEPES-buffrad saltlösning och överförs sedan till hypoton lösning, fixeras i metanol: ättiksyra på en glasskiva och dehydreras i metanol för ytterligare genetisk analys. Hela proceduren påverkar inte vare sig befruktning eller klyvningshastigheter i biopsierade oocyter negativt, eftersom den polära kroppen inte är involverad i ovanstående processer. Karyotypning:

De polära kropparna kommer att överföras till UHN-mikroarraycentret för bestämning av kromosomantal. Analysen kommer att göras med ett kommersiellt kit från Advalytix ( Olympus Life Science Research, München, Tyskland). Detta är ett multiplex PCR-baserat kit som ger en snabb och exakt räkning av alla 23 kromosomer och är skräddarsydd för antalet polära kromosomer. Efter 2 dagar kommer ett enda embryo med en normal karyotyp att överföras till livmoderhålan under ultraljudsledning med hjälp av en Cook-överföringskateter (Cook, Sidney, Australien). Resten av de livsdugliga embryona med en normal karyotyp kommer att frysas (långsam frysning). Lutealt stöd kommer att bestå av progesteron suppositorier 100 mg (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario, Kanada) vaginalt 3 gånger om dagen med början på överföringsdagen och kommer att fortsätta i 2 veckor till slutet av varje cykel när serum beta hCG kommer att tas ut och om du är gravid , CoQ10/placebo kommer att avbrytas. Om du är gravid kommer lutealt stöd att fortsätta till 10 veckors graviditet. Om patienten inte är gravid kommer hon att ha en cykel av endometriestimulering med mikroniserad östradiol, följt av progesteron när en tillräcklig endometrietjocklek har uppmätts. Fyra dagar efteråt kommer 1-2 embryon att tinas och överföras. Lutealt stöd kommer att innefatta östradiol och progesteron som kommer att bibehållas upp till 10 veckor om du är gravid. Dessa cykler av fryst embryonöverföring kommer att fortsätta så länge det finns frysta embryon från samma hämtning.

Studiens slutpunkter kommer att vara:

1. Primärt utfallsmått kommer att vara antalet och procentandelen euploida ägg per uttag

2. Sekundära resultatmått kommer att omfatta:

   • Ovarialt svar
   • Embryonkvalitet
   • Kumulativ graviditetsfrekvens/hämtning
   • Kumulativ födelsetal/hämtning
   • CoQ10-aktivitet i saliv och follikulär vätska genom arNOX-analys

Coenzym Q10-analys arNOX är ett coenzym Q10-hämmat, åldringsrelaterat externt NADH-oxidas (ECTO-NOX) protein på cellytan som också finns i sera och saliv. Den kan generera superoxid mätt som superoxiddismutas-hämmad reduktion av ferricytokrom c (oxiderad cytokrom C). arNOX-aktiviteten hos saliv hos äldre individer hämmas av koenzym Q10. Aktiviteten uppträder först efter 30 års ålder till ett nästan maximum vid ungefär 55 års ålder.

arNOX-aktivitet analyseras från mätningar av superoxidproduktion baserat på standardmetoden där reduktion av ferricytokrom c med superoxid övervakas från ökningen i absorbans vid 550 nm med referens vid 540 nm. Som en ytterligare kontroll av specificiteten för arNOX-aktiviteten tillsätts superoxiddismutas (SOD) nära slutet av analysen för att säkerställa att hastigheten återgick till baslinjen. Analysen består av 150 μl (2 mg/ml) oxiderad ferricytokrom c-lösning och 200 μl saliv tillsatt 2,5 ml analysbuffert (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g KH2,1PO3, Cl0,1PO3, Cl0,1PO3. g MgCl2, 1,35 g glukos löst i 1000 ml avjoniserat vatten, justerat till pH 7,4, filtrerat och lagrat vid 4◦C). Hastigheterna bestäms med hjälp av en spektrofotometer i dubbelvåglängdsläget med kontinuerliga mätningar (över 1 min var 1,5 min). Efter 45 minuter tillsätts 60 μl (innehållande 60 enheter) SOD och analysen fortsätter i ytterligare 45 minuter.

Salivary arNOX visade sig vara en bekväm och icke-invasiv metod för att övervaka arNOX-nivåer i kliniska coenzym Q10-interventionsstudier med svarsnivåer parallella med de som ses med serum och cellulär arNOX (Morre och Morre 2008).

Studera befolkning

Totalt 54 kvinnliga patienter som önskar graviditet kommer att inkluderas i denna studie vid TCART-Toronto Center for Advanced Reproductive Technology. Varje ämne måste uppfylla studiens inkluderings- och exkluderingskriterier

Effektberäkning:

Totalt 54 patienter kommer att delta i denna två behandlingsstudie med parallelldesign. Sannolikheten är 90 procent att studien kommer att upptäcka en behandlingsskillnad vid en tvåsidig med p-värde ≤ 0,01, om den verkliga skillnaden mellan behandlingarna i aneuploidifrekvens är 25 %. Detta är baserat på antagandet att standardavvikelsen för svarsvariabeln är 0,180.

Uppdrag till behandling och randomisering:

Patienterna kommer att tilldelas en datorgenererad randomisering i kronologisk ordning dagen för studieregistreringen. Varje inskriven deltagare kommer att få ett i förväg tilldelat paket som innehåller antingen placebo eller CoQ10 under hela studien. Läkaren kommer att bli blind när det gäller tilldelningen av patienterna. Randomisering kommer att göras innan den första cykeln påbörjas.

Utredarna kommer att hålla ett separat register som relaterar namnen på försökspersonerna till deras kodnummer, för att möjliggöra enkel kontroll av data i ämnesfiler vid behov.

Statistisk analys kommer att göras med student t-test för att campa mellan behandlings- och placebogruppen för alla resultatmått. Effektanalys beräknades för alfa < 0,01.

Förväntade resultat och potentiella fallgropar. Antalet patienter som behövs för studien är rimligt och vi förväntar oss inte att det ska vara ett hinder. Om resultaten i denna studie kommer att överensstämma med djurstudien bör vi kunna visa en signifikant skillnad i antalet euploida embryon mellan test- och kontrollgrupperna, såväl som med de andra utfallsparametrarna. Vi har arbetat i flera månader med UHN microarray-labbet för att optimera användningen av Advalytics multiplex PCR-kit som för närvarande fungerar mycket bra. Vi förväntar oss inga problem med denna komponent av objektet.