Die Wirkung von Co-Enzym Q10 zusammen mit Fruchtbarkeitsmedikamenten auf den Schwangerschaftsausgang der In-vitro-Fertilisation (CoQ10-IVF)

Das Ziel dieser Studie ist es, die Wirksamkeit der CoQ10-Verabreichung in Bezug auf ihre Wirkung auf die Aneuploidierate von Eizellen und die kumulative Lebendgeburtenrate zu bewerten.

Studiendesign Dies ist eine prospektive, randomisierte, Placebo-kontrollierte Studie. Die Studienteilnehmer durchlaufen im Rahmen dieses Protokolls bis zu 3 Zyklen. Alle klinischen Untersuchungen werden in den teilnehmenden Unfruchtbarkeitskliniken durchgeführt.

Die Studie wird ambulant im Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology (TCART) durchgeführt. An der Studie werden 54 Frauen im Alter von 35 bis 43 Jahren teilnehmen, die sich einer IVF-Behandlung unterziehen. Alle Frauen sammeln 2 ml Speichel in einem 5-ml-Polyethylenröhrchen für die Basislinienmessung der coQ10-Aktivität durch den arNOX-Assay (unten beschrieben).

Die Studienteilnehmer werden nach dem Zufallsprinzip entweder Placebo oder COQ10-Kapseln zugeteilt (AOR – Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD-Registrierungscodes 135307). Die Studienteilnehmerinnen nehmen 600 mg CoQ10 einmal täglich oral mit Frühstück oder identischen Placebo-Kapseln für 2 Monate vor einem IVF-Zyklus und bis zu 3 Zyklen, wenn keine Schwangerschaft eintritt. Am Zyklustag 3 beginnen die Probanden mit der ovariellen Stimulation für die In-vitro-Fertilisation, während sie die Einnahme der Ergänzungen fortsetzen. Die kontrollierte ovarielle Stimulation (COH) besteht aus dem mikrodosierten GnRH-Agonisten-Flare-Protokoll, das das Standardprotokoll der Klinik für ältere Frauen ist. COH wird unter Verwendung von rekombinantem FSH (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Kanada) oder humanen menopausalen Gonadotropinen (Menopur, Ferring Inc., Oakville, ON, Kanada) 150 Einheiten zweimal täglich S.C. und Buserelinacetat (Superfact, Sanofi) durchgeführt -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg subkutan BID und wird bis zum Tag vor 10.000 Einheiten humanem Choriongonadotropin (hCG) (Pregnyl, Organon) fortgesetzt. Die Dosierung wird nicht verändert und muss für die Dauer der Studie beibehalten werden. Beide Medikamente werden täglich fortgesetzt, bis die Follikelentwicklung als ausreichend erachtet wird (mindestens 3 Follikel > 17 mm, und der E2-Spiegel ist für die Anzahl der vorhandenen Follikel akzeptabel). Zu diesem Zeitpunkt wird das hCG injiziert, um die endgültige Follikelreifung auszulösen. Die Oozytenentnahme erfolgt 36 Stunden später durch vaginale Ultraschall-geführte Nadelaspiration und unter Verwendung von Lokalanästhesie und leichter Sedierung. Zum Zeitpunkt der Entnahme sammeln die Probanden 2 ml Speichel, zusätzlich werden 2 ml Follikelflüssigkeit aus dem ersten Follikel gesammelt, der aus jedem Eierstock zur Bestimmung der coQ10-Aktivität durch arNOX-Assay abgesaugt wird. Da es nicht möglich ist, den CoQ10-Spiegel in einer einzelnen Zelle zu messen (z. Eizellen), FF stellt die direkte zelluläre Umgebung dar, die das metabolische Profil dieser Zelle widerspiegeln kann. Nach der Entnahme werden die Eizellen mit ICSI befruchtet, um die mütterliche DNA bei der Polkörperbiopsieprobe nicht mit Spermien-DNA zu kontaminieren. Am Folgetag werden alle Eizellen mit 2 Vorkernen einer Biopsie eines oder beider Polkörperchen unterzogen.

Polkörperbiopsie Die Eizelle wird dann mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektionstechnik (ICSI) besamt und in einem Inkubator in Kultur gehalten. Um den Polkörper zu biopsieren, wird die Eizelle von der Haltepipette mit dem Polkörper in der 11-12-Uhr-Position gehalten. In der Zona pellucida wird eine Öffnung angelegt und eine polierte Glasnadel in den Perivitellinraum eingeführt und der Polkörper vorsichtig entfernt.

Der Embryotransfer wird am Morgen des dritten Tages nach der Eizellentnahme durchgeführt.

Polkörper werden in Tröpfchen isotonischer HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und dann in eine hypotonische Lösung überführt, in Methanol: Essigsäure auf einem Glasobjektträger fixiert und für weitere genetische Analysen in Methanol dehydriert. Das gesamte Verfahren beeinträchtigt weder die Befruchtungs- noch die Teilungsrate in biopsierten Oozyten, da der Polkörper nicht an den oben genannten Prozessen beteiligt ist. Karyotypisierung:

Die Polkörperchen werden zur Chromosomenzahlbestimmung in das Microarray-Zentrum des UHN überführt. Die Analyse wird mit einem kommerziellen Kit von Advalytix (Olympus Life Science Research, München, Deutschland) durchgeführt. Dies ist ein Multiplex-PCR-basiertes Kit, das eine schnelle und genaue Zählung aller 23 Chromosomen ermöglicht und auf die Chromosomenzahl des Polarkörpers zugeschnitten ist. Nach 2 Tagen wird ein einzelner Embryo mit normalem Karyotyp unter Ultraschallkontrolle mit einem Cook-Transferkatheter (Cook, Sidney, Australien) in die Gebärmutterhöhle transferiert. Der Rest der lebensfähigen Embryonen mit einem normalen Karyotyp wird eingefroren (langsames Einfrieren). Die Lutealunterstützung besteht aus 100 mg Progesteron-Zäpfchen (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario, Kanada) vaginal 3-mal täglich, beginnend am Tag der Übertragung, und wird für 2 Wochen bis zum Ende jedes Zyklus fortgesetzt, wenn Serum-Beta-hCG entnommen wird und wenn Sie schwanger sind , Coenzym Q10/Placebo wird abgesetzt. Wenn Sie schwanger sind, wird die Lutealunterstützung bis zur 10. Schwangerschaftswoche fortgesetzt. Wenn die Patientin nicht schwanger ist, wird sie einen Zyklus der Stimulation des Endometriums mit mikronisiertem Estradiol erhalten, gefolgt von Progesteron, sobald eine ausreichende Dicke des Endometriums gemessen wurde. Vier Tage später werden 1-2 Embryonen aufgetaut und übertragen. Die Lutealunterstützung umfasst Östradiol und Progesteron, die bei einer Schwangerschaft bis zu 10 Wochen aufrechterhalten werden. Diese Zyklen des Transfers von gefrorenen Embryonen werden fortgesetzt, solange es gefrorene Embryonen aus derselben Entnahme gibt.

Die Studienendpunkte werden sein:

1. Das primäre Ergebnismaß ist die Anzahl und der Prozentsatz euploider Eier pro Entnahme

2. Zu den sekundären Ergebnismessungen gehören:

   • Eierstockreaktion
   • Qualität des Embryos
   • Kumulative Schwangerschaftsrate / Abruf
   • Kumulative Lebendgeburtenrate / Abruf
   • CoQ10-Aktivität in Speichel und Follikelflüssigkeit durch arNOX-Assay

Coenzym-Q10-Assay arNOX ist ein durch Coenzym Q10 gehemmtes, alterungsbedingtes externes NADH-Oxidase (ECTO-NOX)-Protein der Zelloberfläche, das auch in Seren und Speichel vorhanden ist. Es ist in der Lage, Superoxid zu erzeugen, gemessen als durch Superoxid-Dismutase gehemmte Reduktion von Ferricytochrom c (oxidiertes Cytochrom C). Die arNOX-Aktivität des Speichels älterer Menschen wird durch Coenzym Q10 gehemmt. Die Aktivität tritt erstmals nach dem 30. Lebensjahr auf und erreicht mit etwa 55 Jahren ein nahezu maximales Maximum.

Die arNOX-Aktivität wird aus Messungen der Superoxidproduktion basierend auf dem Standardverfahren bestimmt, bei dem die Reduktion von Ferricytochrom c durch Superoxid anhand der Zunahme der Extinktion bei 550 nm mit Referenz bei 540 nm überwacht wird. Als weitere Überprüfung der Spezifität der arNOX-Aktivität wird gegen Ende des Assays Superoxiddismutase (SOD) zugegeben, um sicherzustellen, dass die Rate zur Grundlinie zurückgekehrt ist. Der Assay besteht aus 150 μl (2 mg/ml) oxidierter Ferricytochrom-c-Lösung und 200 μl Speichel, die zu 2,5 ml Assay-Puffer (8,06 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,18 g Na 2 HPO4, 0,26 g KH2PO4, 0,13 g CaCl2, 0,1 g MgCl2, 1,35 g Glucose in 1000 ml deionisiertem Wasser gelöst, auf pH 7,4 eingestellt, filtriert und bei 4◦C gelagert). Die Raten werden unter Verwendung eines Spektrophotometers im Zweiwellenlängenmodus mit kontinuierlichen Messungen (über 1 min alle 1,5 min) bestimmt. Nach 45 min werden 60 &mgr;l (enthaltend 60 Einheiten) SOD zugegeben und der Assay weitere 45 min fortgesetzt.

Speichel-arNOX erwies sich in klinischen Coenzym-Q10-Interventionsstudien als bequeme und nicht-invasive Methode zur Überwachung der arNOX-Spiegel, wobei die Ansprechwerte denen von Serum- und zellulärem arNOX entsprachen (Morre und Morre 2008).

Studienpopulation

Insgesamt 54 Patientinnen, die eine Schwangerschaft wünschen, werden in diese Studie am TCART-Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology aufgenommen. Jedes Fach muss die Einschluss- und Ausschlusskriterien der Studie erfüllen

Leistungsberechnung:

Insgesamt werden 54 Patienten an dieser Paralleldesign-Studie mit zwei Behandlungen teilnehmen. Die Wahrscheinlichkeit beträgt 90 Prozent, dass die Studie einen Behandlungsunterschied bei einem zweiseitigen p-Wert ≤ 0,01 erkennt, wenn der wahre Unterschied zwischen den Behandlungen in der Aneuploidierate 25 % beträgt. Dies basiert auf der Annahme, dass die Standardabweichung der Antwortvariablen 0,180 beträgt.

Zuordnung zur Behandlung und Randomisierung:

Die Patienten werden am Tag der Aufnahme in die Studie in chronologischer Reihenfolge einer computergenerierten Randomisierung zugeteilt. Jeder eingeschriebene Teilnehmer erhält für die Dauer der Studie ein vorab zugewiesenes Paket, das entweder Placebo oder Coenzym Q10 enthält. Der Arzt wird hinsichtlich der Zuordnung der Patienten verblindet. Die Randomisierung erfolgt vor Beginn des ersten Zyklus.

Die Ermittler führen eine separate Aufzeichnung, in der die Namen der Probanden mit ihren Codenummern in Beziehung gesetzt werden, um bei Bedarf eine einfache Überprüfung der Daten in den Probandenakten zu ermöglichen.

Die statistische Analyse wird mit einem Studenten-t-Test durchgeführt, um zwischen der Behandlungs- und der Placebogruppe für alle Ergebnismessungen zu campen. Die Leistungsanalyse wurde für Alpha < 0,01 berechnet.

Erwartete Ergebnisse und potenzielle Fallstricke. Die für die Studie benötigte Patientenzahl ist angemessen und wir erwarten kein Hindernis. Wenn die Ergebnisse dieser Studie der Tierstudie entsprechen, sollten wir in der Lage sein, einen signifikanten Unterschied in der Anzahl euploider Embryonen zwischen der Test- und der Kontrollgruppe sowie bei den anderen Ergebnisparametern zu zeigen. Wir arbeiten seit mehreren Monaten mit dem UHN-Microarray-Labor zusammen, um die Verwendung des Multiplex-PCR-Kits von Advalytics zu optimieren, das derzeit sehr gut funktioniert. Wir erwarten keine Probleme mit dieser Komponente des Objekts.