Koentsyymi Q10:n vaikutus yhdessä hedelmällisyyslääkkeiden kanssa in vitro -hedelmöityksen raskauden lopputulokseen (CoQ10-IVF)

Tämän tutkimuksen tavoitteena on arvioida CoQ10:n antamisen tehokkuutta suhteessa sen vaikutukseen munasolujen aneuploidiaan ja kumulatiiviseen elävänä syntyvyyteen.

Tutkimussuunnitelma Tämä on prospektiivinen satunnaistettu lumekontrolloitu tutkimus. Tutkimukseen osallistujat käyvät läpi jopa 3 sykliä osana tätä protokollaa. Kaikki kliiniset arvioinnit suoritetaan osallistuvilla hedelmättömyysklinikoilla.

Tutkimus järjestetään avohoidossa Toronto Center for Advanced Reproductive Technologyssa (TCART). Tutkimukseen osallistuu 54 IVF-hoitoa saavaa 35-43-vuotiasta naista. Kaikki naiset keräävät 2 ml sylkeä 5 ml:n polyeteeniputkeen coQ10-aktiivisuuden perustason mittaamiseksi arNOX-määrityksellä (kuvattu alla).

Tutkimukseen osallistujat jaetaan satunnaisesti joko lumelääkkeeseen tai COQ10-kapseleihin (AOR - Advanced Orthomolecular Research Inc. 19 St NE Calgary, Alberta, NHPD rekisteröintikoodit 135307). Tutkimukseen osallistujat ottavat 600 mg CoQ10:tä suun kautta kerran päivässä aamiaisen tai identtisten lumekapseleiden aikana 2 kuukauden ajan ennen IVF-sykliä ja enintään 3 sykliä, jos raskautta ei tapahdu. Syklin 3 päivänä koehenkilöt aloittavat munasarjojen stimulaation koeputkihedelmöitystä varten ja jatkavat lisäravinteiden käyttöä. Kontrolloitu munasarjojen stimulaatio (COH) koostuu mikroannos GnRH agonist flare protokollasta, joka on klinikan vakioprotokolla iäkkäille naisille. COH tehdään käyttämällä rekombinantti-FSH:ta (Puregon; Schering-Plough Inc., Mississauga, ON, Kanada) tai ihmisen menopausaalisille gonadotropiineille (Menopur, Ferring Inc, Oakville, ON, Kanada) 150 yksikköä kahdesti päivässä S.C. ja busereliiniasetaattia (Superfact, Sanofi) -Aventis Canada Inc, Laval, Quebec) 0,05 mg ihonalaisesti B.I.D ja jatkuu päivään ennen 10 000 yksikköä ihmisen koriongonadotropiinia (hCG) (Pregnyl, Organon). Annosta ei muuteta, ja se on säilytettävä tutkimuksen ajan. Molempia lääkkeitä jatketaan päivittäin, kunnes munarakkuloiden kehitys katsotaan riittäväksi (vähintään 3 follikkelia > 17 mm ja E2-taso on hyväksyttävä follikkelien lukumäärään nähden), jolloin hCG-injektio laukaistaan ​​lopullisen follikkelin kypsymisen. Munasolujen talteenotto tehdään 36 tuntia myöhemmin emättimen ultraääniohjatulla neulaimulla ja käyttämällä paikallispuudutusta ja lievää sedaatiota. Hakuhetkellä koehenkilöt keräävät 2 ml sylkeä, lisäksi 2 ml follikkelinestettä kerätään ensimmäisestä munasarjasta aspiroidusta follikkelista coQ10-aktiivisuuden määrittämiseksi arNOX-määrityksellä. Koska CoQ10-tasoja ei ole mahdollista mitata yksittäisissä soluissa (esim. munasolut), FF edustaa suoraa soluympäristöä, joka voi heijastaa tämän solun metabolista profiilia. Noudon jälkeen munasolut hedelmöitetään ICSI:llä, jotta äidin DNA ei kontaminoituisi polaarisen kehon biopsianäytteen aikana siittiöiden DNA:lla. Seuraavana päivänä kaikille oosyyteille, joissa on kaksi esitumaa, tehdään biopsia yhdestä tai molemmista polaarisista kappaleista.

Polaarisen kehon biopsia Munasolu inseminoidaan sitten käyttämällä intrasytoplasmista siittiöinjektiota (ICSI) ja sitä pidetään viljelmässä inkubaattorissa. Polaarisen kehon biopsiaa varten munasolua pidetään pitopipetillä, jolloin napakappale on kello 11-12 asennossa. Zona pellucidaan tehdään aukko ja kiillotettu lasineula työnnetään perivitelliiniseen tilaan ja napakappale poistetaan varovasti.

Alkionsiirto suoritetaan kolmantena päivänä munasolun talteenoton jälkeisenä aamuna.

Polaariset kappaleet pestään isotonisen HEPES-puskuroidun suolaliuoksen pisaroilla ja siirretään sitten hypotoniseen liuokseen, kiinnitetään metanoli:etikkahappoon lasilevylle ja dehydratoidaan metanolissa geneettistä lisäanalyysiä varten. Koko toimenpide ei vaikuta haitallisesti hedelmöittymiseen tai lohkeamisnopeuteen biopsioiduissa munasoluissa, koska polaarinen keho ei ole osallisena edellä mainituissa prosesseissa. Karyotyypitys:

Polaariset kappaleet siirretään UHN-mikrosirukeskukseen kromosomimäärän määritystä varten. Analyysi tehdään Advalytixin (Olympus Life Science Research, München, Saksa) kaupallisella pakkauksella. Tämä on multiplex PCR-pohjainen sarja, joka tarjoaa nopean ja tarkan laskennan kaikista 23 kromosomista ja on räätälöity polaarisen kehon kromosomimäärän mukaan. Kahden päivän kuluttua yksittäinen alkio, jolla on normaali karyotyyppi, siirretään kohdun onteloon ultraääniohjauksella käyttäen Cookin siirtokatetria (Cook, Sidney, Australia). Muut elinkelpoiset alkiot, joilla on normaali karyotyyppi, jäädytetään (hidas jäädytys). Luteaalituki koostuu 100 mg:n progesteroniperäisistä peräpuikoista (Kingsway Pharmacy, Toronto, Ontario Kanada) emättimeen 3 kertaa päivässä siirtopäivästä alkaen ja jatkuu 2 viikkoa kunkin jakson loppuun asti, jolloin seerumin beeta-hCG otetaan ja jos olet raskaana. , CoQ10/ lumelääke lopetetaan. Jos raskaana, luteaalituki jatkuu 10 raskausviikkoon asti. Jos potilas ei ole raskaana, hänelle suoritetaan kohdun limakalvon stimulaatiosykli mikronisoidulla estradiolilla, jota seuraa progesteroni, kun riittävä kohdun limakalvon paksuus on mitattu. Neljän päivän kuluttua 1-2 alkiota sulatetaan ja siirretään. Luteaalituki sisältää estradiolia ja progesteronia, joita ylläpidetään 10 viikkoa raskauden aikana. Näitä pakastealkioiden siirtojaksoja jatketaan niin kauan kuin pakastettuja alkioita on samasta hausta.

Tutkimuksen päätepisteet ovat:

1. Ensisijainen tulosmitta on euploidisten munien lukumäärä ja prosenttiosuus hakua kohti

2. Toissijaisiin tulostoimenpiteisiin kuuluvat:

   • Munasarjareaktio
   • Alkion laatu
   • Kumulatiivinen raskausaste / haku
   • Kumulatiivinen elävä syntyvyys / haku
   • CoQ10-aktiivisuus syljessä ja follikulaarisessa nesteessä arNOX-määrityksellä

Koentsyymi Q10 -määritys arNOX on koentsyymi Q10:n estämä, ikääntymiseen liittyvä ulkoinen NADH-oksidaasi (ECTO-NOX) -proteiini solupinnalla, jota on myös seerumeissa ja syljessä. Se pystyy tuottamaan superoksidia mitattuna superoksididismutaasin estämänä ferrisytokromi c:n (hapettuneen sytokromi C) pelkistyksenä. Koentsyymi Q10 estää iäkkäiden ihmisten syljen arNOX-aktiivisuuden. Aktiivisuus ilmaantuu ensimmäisen kerran 30 vuoden iän jälkeen lähes maksimissaan noin 55 vuoden iässä.

arNOX-aktiivisuus määritetään superoksidituotannon mittauksista, jotka perustuvat standardimenetelmään, jossa ferrisytokromi c:n pelkistymistä superoksidilla seurataan absorbanssin kasvusta 550 nm:ssä vertailun aallonpituudella 540 nm. Lisätarkistuksena arNOX-aktiivisuuden spesifisyydestä superoksididismutaasia (SOD) lisätään lähelle määrityksen loppua sen varmistamiseksi, että nopeus palasi perusviivalle. Määritys koostuu 150 μl:sta (2 mg/ml) hapetettua ferrisytokromi c -liuosta ja 200 μl:sta sylkeä lisättynä 2,5 ml:aan määrityspuskuria (8,06 g NaC1, 0,2 g KC1, 0,18 g Na 2HPO4, 0,18 g Na 2HPO4, 0,18 g Na 2HPO4, 0,26 g. g MgCl2, 1,35 g glukoosia liuotettuna 1000 ml:aan deionisoitua vettä, säädetty pH-arvoon 7,4, suodatettu ja säilytetty 4 °C:ssa). Nopeudet määritetään käyttämällä spektrofotometriä kaksoisaallonpituusmoodissa jatkuvilla mittauksilla (yli 1 min 1,5 minuutin välein). 45 minuutin kuluttua lisätään 60 μl (sisältää 60 yksikköä) SOD:ta ja määritystä jatketaan vielä 45 minuuttia.

Syljen arNOX havaittiin olevan kätevä ja ei-invasiivinen menetelmä arNOX-tasojen seuraamiseksi kliinisissä koentsyymi Q10 -interventiotutkimuksissa vastetasoilla, jotka ovat samansuuntaisia ​​seerumin ja solun arNOX:n kanssa (Morre ja Morre 2008).

Tutkimuspopulaatio

Yhteensä 54 naispotilasta, jotka haluavat tulla raskaaksi, otetaan mukaan tähän tutkimukseen TCART-Toronto Center for Advanced Reproductive Technology -keskuksessa. Jokaisen opiskeluaineen tulee täyttää tutkimukseen osallistumis- ja poissulkemiskriteerit

Teholaskenta:

Yhteensä 54 potilasta osallistuu tähän kahden hoidon rinnakkaisen suunnittelun tutkimukseen. Todennäköisyys on 90 prosenttia, että tutkimus havaitsee hoitoeron kahdella puolella p-arvolla ≤ 0,01, jos hoitojen todellinen ero aneuploidiassa on 25 %. Tämä perustuu oletukseen, että vastemuuttujan keskihajonta on 0,180.

Hoito- ja satunnaistaminen:

Potilaat jaetaan kronologisessa järjestyksessä tutkimukseen ilmoittautumispäivänä tietokoneella luotuun satunnaistukseen. Jokainen osallistuja saa ennalta määrätyn paketin, joka sisältää joko lumelääkettä tai CoQ10:tä tutkimuksen ajaksi. Lääkäri on sokea potilaiden jakamisesta. Satunnaistaminen tehdään ennen ensimmäisen jakson aloittamista.

Tutkijat pitävät erillistä kirjaa, joka yhdistää koehenkilöiden nimet heidän koodinumeroihinsa, jotta aihetiedostoissa olevat tiedot voidaan tarvittaessa helposti tarkistaa.

Tilastollinen analyysi tehdään opiskelijan t-testillä leiriläiselle hoito- ja plaseboryhmän välillä kaikkien tulosmittausten osalta. Tehoanalyysi laskettiin alfalle < 0,01.

Odotetut tulokset ja mahdolliset sudenkuopat. Tutkimukseen tarvittava potilasmäärä on kohtuullinen, emmekä odota sen olevan este. Jos tämän tutkimuksen tulokset ovat eläinkokeita, meidän pitäisi pystyä osoittamaan merkittävä ero euploidisten alkioiden lukumäärässä testi- ja kontrolliryhmien välillä sekä muiden tulosparametrien kanssa. Olemme työskennelleet useita kuukausia UHN-mikrosirulaboratorion kanssa optimoidaksemme Advalyticsin multipleksisen PCR-sarjan käytön, joka tällä hetkellä toimii erittäin hyvin. Emme odota ongelmia tämän objektin komponentin kanssa.