重度のストレス下にある免疫不全患者におけるCMV感染の再活性化 (RECYSTRESS)

これは、ICU に入院した CMV 血清反応陽性患者 (小児および成人) の多施設前向き観察研究です。 三次教育病院の 2 つの小児 ICU ユニットと 4 つの成人 ICU ユニットは、それぞれ 48 か月と 36 か月間募集されます。

研究計画 ICUへの入院時に、患者（グループAおよびB）は、包含/除外基準についてスクリーニングされ、書面によるインフォームドコンセントが得られた後、患者は登録されます。 臨床的重症度は、標準化されたスコアシステム (それぞれ PRISM III および APACHI II) を使用して推定されます。 関連するすべての人口統計、病歴、臨床症状、および医学的介入がデータベースに入力されます。 支持療法（強心薬またはコルチコステロイド）を開始する前に、ストレスの生物学的マーカーを測定するために血液と唾液を採取します。 CMV-IgG抗体およびCMV-DNAをそれぞれ測定するために、血清および全血を採取する。 CMV血清陰性患者は、さらなる評価から除外されます。 血清陽性の患者は、28日間前向きに追跡されます。 毎週のフォローアップ (入院の 7 日目、14 日目、21 日目、28 日目) には、臨床および実験室での評価、治療介入の文書化、および CMV 再活性化評価 (CMV-DNA 検出) が含まれます。 ストレスマーカーは、7日目にのみ再検査されます。28日目（フォローアップの終わり）に、臨床結果が記録されます。

患者のランダムなサブセット（20人の子供と20人の成人）で、炎症の細胞内シグナル伝達経路と特定の免疫応答が研究されます。

実験方法

A）CMVの血清学：血清CMV-IgG抗体は、病院の血清学研究室で酵素免疫測定法（Elisa、Abbott Laboratories）によって測定されます。

B) 生物学的ストレス指標の推定

B.1。 遊離コルチゾールの測定。 唾液サンプルを 1 日 3 回 (午前 8 時、午後 2 時、午後 8 時) 採取し、特別な合成綿棒 (Salivetta-Salivette、Sarsted ®) を使用して概日パターンのコルチゾール分泌を測定し、-70oC で保存します。 コルチゾールレベルは、電気化学発光イムノアッセイ（Elecsys Cortisol試薬キット、ROCHE）で決定されます。

B.2.血漿カテコールアミン。 カテコールアミンレベル（ノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン）は、強心薬による開始療法の前に測定されます。 サンプルは、強心薬を投与されていない患者でのみ、患者を仰向けにして静脈カテーテルから採取されます。 血漿は-85℃で保存されます。 液体 HPLC 逆相 (高速液体クロマトグラフィー - 逆相) が使用されます。

B.3. 血清ＴＮＦ－αは、定量的サンドイッチ酵素免疫測定法（Ｅｌｅｃｓｙｓ、ＲＯＣＨＥ）によって測定される。

C) 全血および気管支肺胞洗浄液 (BAL、換気患者) からの CMV-DNA の検出および定量化。 患者が 28 日目より前に退院した場合、CMV-DNA 測定のために唾液を採取するために自宅で唾液が与えられ (家庭用冷蔵庫に保管されます)、28 日目に返却されます。 サンプルは-70℃で保存され、各患者からのすべてのサンプルが同時に検査されます。 DNA 抽出とリアルタイム PCR は、市販のキット (Nanogen Advanced Diagnostics) によって実行されます。 CMV の主要前初期抗原 (MIEA) をコードする遺伝子領域が検出されます。 すべての PCR 検査は、ギリシャのアテネにある Attikon University Hospital の Cytology Laboratory で実施されます (P. Karakitsos 准教授)。

D) 全細胞および末梢血リンパ球からの核抽出物におけるグルココルチコイド受容体 (GR) および核因子κB (NFκB) の測定は、アテネ大学生物化学科 (Ass. P. Moutsatsou 教授)8

E) CMVに対する特異的免疫応答。 CMV ポリペプチド (pp65 抗原を含む) によるインビトロ刺激後の末梢血からの CD4+ および CD8+ T リンパ球の特異的免疫応答は、細胞内染色 (細胞内染色、ICS) で研究されます。 ＣＤ４＋（ＣＦＳＥ）の増殖およびＣＤ８＋（パーフォリンおよびグランザイムＢ）の細胞毒性が評価される。

統計分析 データ分析では、大人と子供を別々に調べます。 CMV再活性化のない血清陽性患者は、対照群として使用されます。 ≤0.05 の p 値 (p) は、統計的有意性の基準です。 T 検定とカイ 2 乗検定は、定量的および定性的な分析に使用されますが、Mantel-Haenzel 法は、2 つのグループ間の異なる結果 (死亡率、挿管など) の相対リスクを計算するために使用されます。 CMV の再活性化と臨床転帰に関連する潜在的な危険因子を特定するために、統計プログラム SAS v.9 を使用したロジスティック回帰分析が実行されます。

サンプル計算 研究サンプルサイズを計算するために、統計プログラム EpiInfo バージョン 6 が使用されました。 成人からの最近のデータに基づくと、30% が ICU にいる間に CMV の再活性化を示す可能性があります。 小児および成人の ICU での死亡率は、それぞれ約 8% および 63% に達すると推定されています。 最近のデータは、CMV の再活性化が死亡率 (RR=1,93) および罹患率 (RR=5,70) の増加と関連していることを示唆しています。 サンプル サイズは、99% の信頼区間と 90% の統計的検出力の基準を満たすように計算されました。 CMV(+) 集団には、165 人の子供と 109 人の大人が含まれるはずであると推定しました。

ワークパッケージ WP1 および WP2 には臨床研究が含まれます。子供と大人のそれぞれの登録と臨床フォローアップ。 すべてのデータ収集は、匿名データベースに入力されます。これには、人口統計データ、過去の履歴、臨床および検査評価、臨床管理、および入院時およびフォローアップ期間中の介入が含まれます。 大人と子供は別々に評価されます。 CMV の結果が提供されると (WP4)、CMV の再活性化に関連する危険因子と有害な臨床転帰が直接 (つまり、 肺臓炎、熱性エピソード、および肝炎) および間接的に関連する (すなわち、 ICU滞在の延長や人工呼吸器の使用、細菌感染率の増加など）を検討します。

WP3 には、臨床 (WP3.1 および WP 3.2) および基礎研究 (WP3.3) からのストレスの評価が含まれます。 アプローチ。 生化学的ストレスマーカーは、入院時と7日目に評価され、ストレスの持続時間を調べます。 併用薬物投与が考慮される。 ストレス マーカーは、CMV の再活性化および臨床転帰と関連付けられ、今後の研究で特定可能な危険因子として使用できるかどうかを調べます。 WP3.3では、コホートのサブセットにおける炎症の細胞シグナル伝達経路が研究されます。 具体的には、患者の単核細胞における NFκB 活性化とグルココルチコイド受容体感受性の相互作用が評価され、CMV 再活性化および転帰と相関します。

WP4 には、さまざまな生物学的サンプルにおける CMV-DNA の前向き検出と定量化が含まれます。 すべてのデータはメイン データベースに含まれ、さらに重要なことに、将来的に他のヘルペス ウイルスを検出できるように DNA バンクが形成されます。

WP5 では、患者のサブセットにおける CMV に対する特異的な免疫反応を評価します。 これらは、基礎疾患、再活性化、ストレスと相関します。 さらに、これらの実験からの上清のバンクが、将来的にサイトカイン (ルミネックス) を測定するために形成されます。