Reaktywacja zakażenia CMV u pacjentów z prawidłową odpornością w warunkach silnego stresu (RECYSTRESS)

Jest to wieloośrodkowe prospektywne badanie obserwacyjne seropozytywnych pacjentów CMV (dzieci i dorosłych) przyjętych na OIOM. Dwa oddziały intensywnej terapii dla dzieci i cztery dla dorosłych w szpitalach uniwersyteckich będą rekrutować odpowiednio na 48 i 36 miesięcy.

Plan badań Po przyjęciu na OIT pacjenci (grupa A i B) zostaną poddani badaniu przesiewowemu pod kątem kryteriów włączenia/wyłączenia i po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjent zostanie włączony. Ciężkość kliniczna zostanie oszacowana przy użyciu standardowych systemów punktacji (odpowiednio PRISM III i APACHI II). Wszystkie istotne dane demograficzne, historia medyczna, prezentacja kliniczna i interwencje medyczne zostaną wprowadzone do bazy danych. Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia wspomagającego (inotropy lub kortykosteroidy) zostanie pobrana krew i ślina w celu oznaczenia biologicznych markerów stresu. Surowica i krew pełna zostaną pobrane w celu oznaczenia odpowiednio przeciwciał CMV-IgG i CMV-DNA. Pacjenci seronegatywni w kierunku CMV zostaną wykluczeni z dalszej oceny. Pacjenci seropozytywni będą obserwowani prospektywnie przez 28 dni. Cotygodniowa kontrola (7, 14, 21 i 28 dzień hospitalizacji) będzie obejmowała: ocenę kliniczną i laboratoryjną, dokumentację interwencji terapeutycznej oraz ocenę reaktywacji CMV (wykrycie CMV-DNA). Markery stresu zostaną ponownie zbadane dopiero w dniu 7. W dniu 28 (koniec obserwacji) wynik kliniczny zostanie odnotowany.

W losowej podgrupie pacjentów (20 dzieci i 20 dorosłych) zbadany zostanie wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy stanu zapalnego i specyficzne odpowiedzi immunologiczne.

Metody laboratoryjne

A) Serologia w kierunku CMV: Przeciwciała CMV-IgG w surowicy będą mierzone metodą enzymatycznego testu immunologicznego (Elisa, Abbott Laboratories) w szpitalnym laboratorium serologicznym.

B) Oszacowanie biologicznych wskaźników stresu

B.1. Pomiar wolnego kortyzolu. Próbki śliny będą pobierane trzy razy dziennie (8.00, 14.00 i 20.00) w celu określenia rytmu dobowego wydzielania kortyzolu za pomocą specjalnych wacików syntetycznych (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) i przechowywane w temperaturze -70oC. Poziomy kortyzolu zostaną określone za pomocą elektrochemiluminescencyjnego testu immunologicznego (zestaw odczynników Elecsys Cortisol, ROCHE).

B.2. katecholaminy osocza. Stężenie katecholamin (noradrenaliny, adrenaliny i dopaminy) będzie mierzone przed rozpoczęciem terapii jakimkolwiek środkiem inotropowym. Próbki będą pobierane z cewnika żylnego, gdy pacjent leży na plecach, tylko u pacjentów nieotrzymujących leków inotropowych. Osocze będzie przechowywane w temperaturze -85oC. Wykorzystana zostanie faza odwrócona HPLC cieczowa (wysokosprawna chromatografia cieczowa - faza odwrócona).

B.3. Stężenie TNF-a w surowicy będzie mierzone metodą ilościowego testu immunologicznego typu kanapka z enzymami (Elecsys, ROCHE).

C) Wykrywanie i oznaczanie ilościowe CMV-DNA z pełnej krwi i popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL, u wentylowanych pacjentów). Jeśli pacjent zostanie wypisany przed 28. dniem, w domu zostaną podane ślinianki do pobrania śliny do oznaczenia CMV-DNA (przechowywane w domowej lodówce) i zwrócone w 28. dniu. Próbki będą przechowywane w temperaturze -70oC i wszystkie próbki od każdego pacjenta będą badane w tym samym czasie. Ekstrakcja DNA i PCR w czasie rzeczywistym będą wykonywane za pomocą komercyjnych zestawów (Nanogen Advanced Diagnostics). Zostanie wykryty region genu kodujący główny wczesny antygen wirusa CMV (ang. Major Immediate Early Antigen, MIEA). Wszystkie testy PCR będą wykonywane w Laboratorium Cytologicznym Szpitala Uniwersyteckiego Attikon, Ateny, Grecja (profesor nadzwyczajny P. Karakitsos).

D) Pomiary receptora glukokortykoidowego (GR) i czynnika jądrowego κB (NFκB) w pełnych komórkach i ekstraktach jądrowych z limfocytów krwi obwodowej zostaną przeprowadzone metodą immunoblottingu na Wydziale Chemii Biologicznej Uniwersytetu w Atenach (Ass. prof. P. Moutsatsou)8

E) Specyficzna odpowiedź immunologiczna przeciwko CMV. Specyficzna odpowiedź immunologiczna limfocytów T CD4+ i CD8+ z krwi obwodowej po stymulacji in vitro polipeptydami CMV (w tym antygenem pp65) będzie badana za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego (Intracellular Barwienie, ICS). Oceniona zostanie proliferacja CD4+ (CFSE) oraz cytotoksyczność CD8+ (perforyna i granzym B).

Analiza statystyczna W celu analizy danych dorośli i dzieci zostaną zbadani oddzielnie. Pacjenci seropozytywni bez reaktywacji CMV będą wykorzystywani jako grupa kontrolna. Wartość p (p) ≤0,05 jest kryterium istotności statystycznej. Test t i test chi-kwadrat zostaną wykorzystane do analizy ilościowej i jakościowej, podczas gdy metoda Mantela-Haenzela zostanie wykorzystana do obliczenia względnego ryzyka różnych wyników (śmiertelności, intubacji itp.) między dwiema grupami. Aby zidentyfikować potencjalne czynniki ryzyka związane z reaktywacją CMV i wynikiem klinicznym, zostanie przeprowadzona analiza regresji logistycznej przy użyciu programu statystycznego SAS v.9.

Obliczenia próby Do obliczenia liczebności próby badawczej wykorzystano program statystyczny EpiInfo w wersji 6. Na podstawie najnowszych danych uzyskanych od dorosłych, 30% może wykazać reaktywację CMV podczas przebywania na OIOM-ie. Szacuje się, że śmiertelność na oddziałach intensywnej terapii dzieci i dorosłych wynosi odpowiednio około 8% i 63%. Ostatnie dane sugerują, że reaktywacja CMV jest związana ze zwiększoną śmiertelnością (RR=1,93) i chorobowością (RR=5,70). Wielkość próby została obliczona tak, aby spełnić kryteria 99% przedziału ufności i 90% mocy statystycznej. Oszacowaliśmy, że nasza populacja CMV(+) powinna obejmować 165 dzieci i 109 dorosłych.

Pakiety robocze WP1 i WP2 obejmują badania kliniczne; rejestrację i obserwację kliniczną odpowiednio dzieci i dorosłych. Wszystkie gromadzone dane zostaną wprowadzone do anonimowej bazy danych, która będzie zawierać dane demograficzne, przeszłą historię, ocenę kliniczną i laboratoryjną, postępowanie kliniczne i interwencje przy przyjęciu iw okresie obserwacji. Dorośli i dzieci będą oceniani oddzielnie. Po dostarczeniu wyników CMV (WP4) czynniki ryzyka związane z reaktywacją CMV oraz niekorzystne wyniki kliniczne, w tym zarówno te bezpośrednio (tj. zapalenie płuc, epizody gorączkowe i zapalenie wątroby) oraz związane pośrednio (tj. przedłużony pobyt na OIT lub wentylacja mechaniczna oraz zwiększona częstość zakażeń bakteryjnych).

WP3 obejmuje ocenę stresu z badań klinicznych (WP3.1 i WP 3.2) i podstawowych (WP3.3) zbliżać się. Biochemiczne markery stresu zostaną ocenione przy przyjęciu iw dniu 7 w celu zbadania czasu trwania stresu. Zostanie wzięte pod uwagę jednoczesne podawanie leków. Markery stresu zostaną skorelowane z reaktywacją CMV i wynikami klinicznymi w celu zbadania, czy można je wykorzystać jako możliwe do zidentyfikowania czynniki ryzyka w przyszłych badaniach. W WP3.3 zbadane zostaną komórkowe szlaki sygnałowe stanu zapalnego w podzbiorze naszej kohorty. W szczególności zostanie oceniona interakcja aktywacji NFκΒ i wrażliwości receptora glukokortykoidowego w komórkach jednojądrzastych pacjentów i skorelowana z reaktywacją i wynikiem CMV.

WP4 obejmuje prospektywne wykrywanie i oznaczanie ilościowe CMV-DNA w różnych próbkach biologicznych. Wszystkie dane zostaną umieszczone w głównej bazie danych, a co ważniejsze, zostanie utworzony bank DNA w celu ewentualnego wykrycia innych wirusów opryszczki w przyszłości.

WP5 oceni specyficzne odpowiedzi immunologiczne na CMV w podgrupie pacjentów. Będą one skorelowane z chorobą podstawową, reaktywacją i stresem. Ponadto zostanie utworzony bank supernatantów z tych eksperymentów do pomiaru cytokin (Luminex) w przyszłości.