重度压力下免疫功能正常患者 CMV 感染的再激活 (RECYSTRESS)

这是一项针对入住 ICU 的 CMV 血清反应阳性患者（儿童和成人）的多中心前瞻性观察研究。 三级教学医院的两个儿科和四个成人 ICU 单位将分别招募 48 个月和 36 个月。

研究计划 入住 ICU 后，将根据纳入/排除标准筛选患者（A 组和 B 组），并在获得书面知情同意书后纳入患者。 临床严重程度将使用标准化评分系统（分别为 PRISM III 和 APACHI II）进行评估。 所有相关的人口统计学、病史、临床表现和医疗干预措施都将输入数据库。 在开始任何支持性治疗（正性肌力药或皮质类固醇）之前，将采集血液和唾液用于确定压力的生物标志物。 将收集血清和全血以分别测定CMV-IgG抗体和CMV-DNA。 CMV 血清阴性患者将被排除在进一步评估之外。 将对血清反应阳性患者进行前瞻性随访 28 天。 每周随访（住院第 7、14、21 和 28 天）将包括：临床和实验室评估、治疗干预记录和 CMV 再激活评估（CMV-DNA 检测）。 压力标记将仅在第 7 天重新检查。在第 28 天（随访结束）将记录临床结果。

在随机分组的患者（20 名儿童和 20 名成人）中，将研究炎症和特异性免疫反应的细胞内信号通路。

实验室方法

A) CMV 血清学：将在医院血清学实验室通过酶免疫测定法（Elisa，Abbott Laboratories）测量血清 CMV-IgG 抗体。

B) 生物应激指标的估算

B.1. 游离皮质醇的测量。 唾液样本将每天收集三次（上午 8 点、下午 2 点和晚上 8 点），使用特殊合成拭子（Salivetta-Salivette，Sarsted®）确定昼夜节律模式皮质醇分泌，并储存在 -70oC。 皮质醇水平将用电化学发光免疫测定法（Elecsys皮质醇试剂盒，ROCHE）测定。

B.2.血浆儿茶酚胺。 在使用任何正性肌力药物开始治疗之前，将测量儿茶酚胺水平（去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺）。 只有在未接受正性肌力药的患者中，样品才会在患者仰卧的情况下从静脉导管中采集。 血浆将储存在-85oC。 将使用液体 HPLC 反相（高效液相色谱 - 反相）。

B.3. 血清 TNF-a 将通过定量夹心酶免疫测定法（Elecsys，ROCHE）测量。

C) 从全血和支气管肺泡灌洗液（BAL，在通气患者中）检测和定量 CMV-DNA。 如果患者在第 28 天之前出院，将在家中提供唾液以收集唾液用于 CMV-DNA 测定（储存在家用冰箱中）并在第 28 天归还。 样本将储存在-70oC，同时检查每位患者的所有样本。 DNA 提取和实时 PCR 将通过商业试剂盒 (Nanogen Advanced Diagnostics) 进行。 将检测编码 CMV 的主要即刻早期抗原 (MIEA) 的基因区域。 所有 PCR 检测都将在希腊雅典 Attikon 大学医院的细胞学实验室进行（P. Karakitsos 副教授）。

D) 外周血淋巴细胞的全细胞和核提取物中的糖皮质激素受体 (GR) 和核因子 κB (NFκB) 测量将在雅典大学生物化学系（Ass. P. Moutsatsou 教授)8

E)针对CMV的特异性免疫反应。 将用细胞内染色（Intracellular staining，ICS）研究CMV多肽（包括pp65抗原）体外刺激后外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞的特异性免疫反应。 将评估 CD4+ (CFSE) 的增殖和 CD8+（穿孔素和颗粒酶 B）的细胞毒性。

统计分析 对于数据分析，将分别对成人和儿童进行检查。 没有 CMV 再激活的血清反应阳性患者将用作对照组。 ≤0.05 的 p 值 (p) 是统计显着性的标准。 T检验和卡方检验将用于定量和定性分析，而Mantel-Haenzel方法将用于计算两组之间不同结果（死亡率、插管等）的相对风险。 为了确定与 CMV 再激活和临床结果相关的潜在风险因素，将使用统计程序 SAS v.9 进行逻辑回归分析。

样本计算 为了计算研究样本量，使用了统计程序 EpiInfo 版本 6。 根据最近的成人数据，30% 的人可能在 ICU 中表现出 CMV 再激活。 据估计，儿科和成人 ICU 的死亡率分别达到约 8% 和 63%。 最近的数据表明 CMV 再激活与死亡率 (RR=1,93) 和发病率 (RR=5,70) 增加有关。 计算样本量以满足 99% 置信区间和 90% 统计功效的标准。 我们估计我们的 CMV(+) 人群应包括 165 名儿童和 109 名成人。

工作包 WP1 和 WP2 涉及临床研究；分别对儿童和成人进行入组和临床随访。 所有数据收集将输入匿名数据库，其中包括人口统计数据、既往病史、临床和实验室评估、入院时和随访期间的临床管理和干预措施。 成人和儿童将分别接受评估。 一旦提供了 CMV 结果（WP4），与 CMV 再激活相关的风险因素以及不良临床结果，包括直接的（即 肺炎、发热和肝炎）和间接相关（即 延长 ICU 停留时间或机械通气，以及增加细菌感染率）将被检查。

WP3 涉及来自临床（WP3.1 和 WP3.2）和基础研究（WP3.3）的压力评估 方法。 生化压力标记将在入院时和第 7 天进行评估，以检查压力的持续时间。 将考虑伴随给药。 压力标记将与 CMV 再激活和临床结果相关联，以检查它们是否可以用作未来研究的可识别风险因素。 在 WP3.3 中，将研究我们队列子集中炎症的细胞信号通路。 具体而言，将评估患者单核细胞中 NFκB 激活和糖皮质激素受体敏感性的相互作用，并将其与 CMV 再激活和结果相关联。

WP4 涉及不同生物样本中 CMV-DNA 的前瞻性检测和定量。 所有数据都将包含在主数据库中，更重要的是将形成一个 DNA 库，以便将来可能检测到其他疱疹病毒。

WP5 将评估一部分患者对 CMV 的特异性免疫反应。 这些将与潜在的疾病、再激活和压力相关。 此外，这些实验的上清液库将在未来用于测量细胞因子 (Luminex)。