Réactivation de l'infection à CMV chez les patients immunocompétents soumis à un stress sévère (RECYSTRESS)

Il s'agit d'une étude observationnelle prospective multicentrique de patients séropositifs pour le CMV (enfants et adultes) admis en réanimation. Deux unités de soins intensifs pédiatriques et quatre adultes dans des hôpitaux d'enseignement tertiaires recruteront pour 48 et 36 mois respectivement.

Plan de recherche Lors de l'admission aux soins intensifs, les patients (groupes A et B) seront sélectionnés pour les critères d'inclusion/exclusion et après l'obtention du consentement éclairé écrit, le patient sera inscrit. La gravité clinique sera estimée à l'aide de systèmes de scores standardisés (PRISM III et APACHI II respectivement). Tous les antécédents démographiques, médicaux, la présentation clinique et les interventions médicales pertinents seront saisis dans une base de données. Avant d'initier tout traitement de soutien (inotropes ou corticostéroïdes), du sang et de la salive seront prélevés pour la détermination de marqueurs biologiques de stress. Le sérum et le sang total seront prélevés pour la détermination des anticorps CMV-IgG et de l'ADN-CMV respectivement. Les patients séronégatifs pour le CMV seront exclus de toute évaluation ultérieure. Les patients séropositifs seront suivis prospectivement pendant 28 jours. Le suivi hebdomadaire (7e, 14e, 21e et 28e jour d'hospitalisation) comprendra : l'évaluation clinique et biologique, la documentation de l'intervention thérapeutique et l'évaluation de la réactivation du CMV (détection de l'ADN-CMV). Les marqueurs de stress ne seront réexaminés qu'au jour 7. Au jour 28 (fin du suivi), le résultat clinique sera enregistré.

Dans un sous-ensemble aléatoire de patients (20 enfants et 20 adultes), la voie de signalisation intracellulaire de l'inflammation et les réponses immunitaires spécifiques seront étudiées.

Méthodes de laboratoire

A) Sérologie pour le CMV : Les anticorps sériques CMV-IgG seront mesurés par la méthode d'immunodosage enzymatique (Elisa, Abbott Laboratories) dans le laboratoire de sérologie de l'hôpital.

B) Estimation des indicateurs de stress biologique

B.1. Mesure du cortisol libre. Des échantillons de salive seront prélevés trois fois par jour (8h00, 14h00 et 20h00) pour déterminer le schéma circadien de sécrétion de cortisol à l'aide d'écouvillons synthétiques spéciaux (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) et stockés à -70oC. Les niveaux de cortisol seront déterminés par immunodosage par électrochimiluminescence (kit de réactifs Elecsys Cortisol, ROCHE).

B.2. Catécholamines plasmatiques. Les taux de catécholamines (noradrénaline, adrénaline et dopamine) seront mesurés avant l'initiation du traitement avec tout agent inotrope. Des échantillons seront prélevés à partir d'un cathéter veineux avec le patient en décubitus dorsal uniquement chez les patients ne recevant pas d'inotropes. Le plasma sera stocké à -85oC. La phase inverse HPLC Liquide (Chromatographie Liquide Haute Performance - phase inverse) sera utilisée.

B.3. Le TNF-a sérique sera mesuré par la méthode immuno-enzymatique quantitative sandwich (Elecsys, ROCHE).

C) Détection et quantification de l'ADN-CMV à partir de sang total et de lavage bronchoalvéolaire (BAL, chez des patients ventilés). Si un patient sort avant le 28e jour, des salivettes seront données à domicile pour recueillir la salive pour la détermination de l'ADN-CMV (conservées dans le réfrigérateur domestique) et renvoyées le 28e jour. Les échantillons seront conservés à -70oC et tous les échantillons de chaque patient seront examinés en même temps. L'extraction de l'ADN et la PCR en temps réel seront réalisées par des kits commerciaux (Nanogen Advanced Diagnostics). Une région de gène codant pour l'antigène précoce immédiat majeur (MIEA) du CMV sera détectée. Tous les tests PCR seront effectués au laboratoire de cytologie, hôpital universitaire Attikon, Athènes, Grèce (Professeur associé P. Karakitsos).

D) Les mesures du récepteur des glucocorticoïdes (GR) et du facteur nucléaire κB (NFκB) dans des cellules entières et des extraits nucléaires de lymphocytes du sang périphérique seront effectuées par immunotransfert au Département de chimie biologique de l'Université d'Athènes (Ass. Pr P. Moutsatsou)8

E) Réponse immunitaire spécifique contre le CMV. Les réponses immunitaires spécifiques des lymphocytes T CD4+ et CD8+ du sang périphérique après stimulation in vitro avec des polypeptides du CMV (dont l'antigène pp65) seront étudiées par coloration intracellulaire (Intracellular staining, ICS). La prolifération des CD4+ (CFSE) et la cytotoxicité des CD8+ (perforine et granzyme B) seront évaluées.

Analyse statistique Pour l'analyse des données, les adultes et les enfants seront examinés séparément. Les patients séropositifs sans réactivation du CMV seront utilisés comme groupe témoin. Une valeur p (p) ≤0,05 est le critère de signification statistique. Le test T et le test du chi carré seront utilisés pour l'analyse quantitative et qualitative, tandis que la méthode de Mantel-Haenzel sera utilisée pour calculer le risque relatif de différents résultats (mortalité, intubation, etc.) entre les deux groupes. Pour identifier les facteurs de risque potentiels associés à la réactivation du CMV et aux résultats cliniques, une analyse de régression logistique à l'aide du programme statistique SAS v.9 sera effectuée.

Calcul de l'échantillon Pour calculer la taille de l'échantillon de l'étude, le programme statistique EpiInfo version 6 a été utilisé. Sur la base de données récentes provenant d'adultes, 30 % peuvent présenter une réactivation du CMV pendant leur séjour aux soins intensifs. Le taux de mortalité dans les unités de soins intensifs pédiatriques et adultes a été estimé à environ 8 % et 63 % respectivement. Des données récentes suggèrent que la réactivation du CMV est associée à une augmentation de la mortalité (RR=1,93) et de la morbidité (RR=5,70). La taille de l'échantillon a été calculée pour répondre aux critères d'intervalle de confiance de 99 % et de puissance statistique de 90 %. Nous avons estimé que notre population CMV(+) devrait comprendre 165 enfants et 109 adultes.

Les modules de travail WP1 et WP2 impliquent la recherche clinique ; l'inscription et le suivi clinique des enfants et des adultes respectivement. Toutes les données collectées seront entrées dans une base de données anonyme qui comprendra des données démographiques, des antécédents, une évaluation clinique et de laboratoire, la gestion clinique et les interventions à l'admission et pendant la période de suivi. Les adultes et les enfants seront évalués séparément. Une fois les résultats CMV fournis (WP4), les facteurs de risque associés à la réactivation du CMV ainsi que les résultats cliniques indésirables, y compris ceux directement (c. pneumonie, épisodes fébriles et hépatite) et indirectement associés (c.-à-d. séjour prolongé en USI ou ventilation mécanique, et augmentation du taux d'infections bactériennes) seront examinés.

WP3 implique l'évaluation du stress à partir d'une recherche clinique (WP3.1 et WP 3.2) et fondamentale (WP3.3) approche. Les marqueurs de stress biochimiques seront évalués à l'admission et au jour 7 pour examiner la durée du stress. L'administration concomitante de médicaments sera prise en compte. Les marqueurs de stress seront corrélés avec la réactivation du CMV et les résultats cliniques afin d'examiner s'ils peuvent être utilisés comme facteurs de risque identifiables pour de futures recherches. Dans le WP3.3, les voies de signalisation cellulaire de l'inflammation dans un sous-ensemble de notre cohorte seront étudiées. Plus précisément, l'interaction de l'activation de NFκΒ et de la sensibilité des récepteurs des glucocorticoïdes dans les cellules mononucléaires des patients sera évaluée et corrélée avec la réactivation et les résultats du CMV.

Le WP4 implique la détection et la quantification prospectives de l'ADN-CMV dans différents échantillons biologiques. Toutes les données seront incluses dans la base de données principale et, plus important encore, une banque d'ADN sera constituée pour la détection éventuelle d'autres virus de l'herpès à l'avenir.

Le WP5 évaluera les réponses immunitaires spécifiques au CMV chez un sous-ensemble de patients. Ceux-ci seront corrélés avec la maladie sous-jacente, la réactivation et le stress. De plus, une banque de surnageants issus de ces expériences sera constituée pour mesurer les cytokines (Luminex) dans le futur.