Reactivering van CMV-infectie bij immuuncompetente patiënten onder ernstige stress (RECYSTRESS)

Dit is een multicenter prospectieve observationele studie van CMV-seropositieve patiënten (kinderen en volwassenen) die op de IC zijn opgenomen. Twee pediatrische en vier volwassen ICU-afdelingen in tertiaire academische ziekenhuizen zullen rekruteren voor respectievelijk 48 en 36 maanden.

Onderzoeksplan Bij opname op de IC worden patiënten (groep A en B) gescreend op inclusie-/exclusiecriteria en na verkregen schriftelijke geïnformeerde toestemming wordt de patiënt ingeschreven. De klinische ernst zal worden geschat met behulp van gestandaardiseerde scoresystemen (respectievelijk PRISM III en APACHI II). Alle relevante demografie, medische geschiedenis, klinische presentatie en medische interventies worden in een database ingevoerd. Voorafgaand aan het starten van een ondersteunende behandeling (inotropen of corticosteroïden) zullen bloed en speeksel worden verkregen voor de bepaling van biologische markers van stress. Serum en volbloed worden afgenomen voor de bepaling van respectievelijk CMV-IgG-antistoffen en CMV-DNA. CMV-seronegatieve patiënten zullen worden uitgesloten van verdere evaluatie. Seropositieve patiënten zullen gedurende 28 dagen prospectief gevolgd worden. Wekelijkse follow-up (7e, 14e, 21e en 28e dag van ziekenhuisopname) omvat: klinische en laboratoriumevaluatie, documentatie van therapeutische interventie en CMV-reactiveringsbeoordeling (CMV-DNA-detectie). Stressmarkers worden pas op dag 7 opnieuw onderzocht. Op dag 28 (einde van de follow-up) wordt het klinische resultaat geregistreerd.

In een willekeurige subgroep van patiënten (20 kinderen en 20 volwassenen) zal de intracellulaire signaalroute van ontsteking en specifieke immuunresponsen bestudeerd worden.

Laboratoriummethoden

A) Serologie voor CMV: Serum CMV-IgG-antilichamen zullen worden gemeten met de Enzyme Immunoassay-methode (Elisa, Abbott Laboratories) in het serologielaboratorium van het ziekenhuis.

B) Schatting van biologische stressindicatoren

B.1. Meting van vrij cortisol. Speekselmonsters worden drie keer per dag (8.00 uur, 14.00 uur en 20.00 uur) afgenomen om de cortisolsecretie volgens het circadiane patroon te bepalen met behulp van speciale synthetische wattenstaafjes (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) en worden bewaard bij -70oC. Cortisolniveaus zullen worden bepaald met elektrochemiluminescentie-immunoassay (Elecsys Cortisol-reagenskit, ROCHE).

B.2. Plasma-catecholamines. De catecholaminespiegels (noradrenaline, adrenaline en dopamine) zullen worden gemeten voordat de behandeling met een inotroop middel wordt gestart. Alleen bij patiënten die geen inotropen krijgen, worden monsters genomen uit een veneuze katheter met de patiënt in rugligging. Plasma wordt bewaard bij -85oC. De Liquid HPLC reverse phase (High Performance Liquid Chromatography - reverse phase) zal worden gebruikt.

B.3. Serum TNF-a zal worden gemeten door kwantitatieve-sandwich-Enzyme Immunoassay-methode (Elecsys, ROCHE).

C) Detectie en kwantificering van CMV-DNA uit volbloed en bronchoalveolaire lavage (BAL, bij beademde patiënten). Als een patiënt vóór dag 28 wordt ontslagen, worden er thuis speekselzakjes gegeven om speeksel op te vangen voor CMV-DNA-bepaling (bewaard in de koelkast thuis) en op dag 28 teruggegeven. Monsters worden bij -70oC bewaard en alle monsters van elke patiënt worden tegelijkertijd onderzocht. DNA-extractie en real-time PCR zullen worden uitgevoerd door commerciële kits (Nanogen Advanced Diagnostics). Er zal een genregio worden gedetecteerd die codeert voor het Major Immediate Early Antigen (MIEA) van CMV. Alle PCR-testen zullen worden uitgevoerd in het Cytologielaboratorium, Attikon University Hospital, Athene, Griekenland (Associate Prof P. Karakitsos).

D) Glucocorticoïde receptor (GR) en nucleaire factor KB (NFκB) metingen in volledige cellen en nucleaire extracten van perifere bloedlymfocyten zullen worden uitgevoerd door middel van immunoblotting bij de afdeling Biologische Chemie, Universiteit van Athene (Ass. prof. P. Moutsatsou)8

E) Specifieke immuunrespons tegen CMV. Specifieke immuunresponsen van CD4+ en CD8+ T-lymfocyten uit perifeer bloed na in vitro stimulatie met CMV-polypeptiden (inclusief pp65-antigeen) zullen bestudeerd worden met intracellulaire kleuring (Intracellulaire kleuring, ICS). De proliferatie van CD4+ (CFSE) en de cytotoxiciteit van CD8+ (perforine en granzyme B) zullen worden beoordeeld.

Statistische analyse Voor de data-analyse worden volwassenen en kinderen apart onderzocht. Seropositieve patiënten zonder CMV-reactivering zullen als controlegroep worden gebruikt. Een p-waarde (p) van ≤0,05 is het criterium voor statistische significantie. T-test en chikwadraattest zullen worden gebruikt voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse, terwijl de Mantel-Haenzel-methode zal worden gebruikt om het relatieve risico op verschillende uitkomsten (mortaliteit, intubatie, enz.) tussen de twee groepen te berekenen. Om potentiële risicofactoren te identificeren die verband houden met CMV-reactivering en klinische uitkomst, zal een logistische regressieanalyse worden uitgevoerd met behulp van het statistische programma SAS v.9.

Steekproefberekening Voor het berekenen van de steekproefomvang werd het statistische programma EpiInfo versie 6 gebruikt. Op basis van recente gegevens van volwassenen kan 30% CMV-reactivering vertonen terwijl ze op de IC liggen. Het sterftecijfer op de pediatrische en volwassen IC wordt geschat op respectievelijk ongeveer 8% en 63%. Recente gegevens suggereren dat CMV-reactivering gepaard gaat met verhoogde mortaliteit (RR=1,93) en morbiditeit (RR=5,70). De steekproefomvang werd berekend om te voldoen aan de criteria van 99% betrouwbaarheidsinterval en 90% statistisch vermogen. We schatten dat onze CMV(+)-populatie 165 kinderen en 109 volwassenen zou moeten omvatten.

Werkpakketten WP1 en WP2 omvatten klinisch onderzoek; inschrijving en klinische follow-up van respectievelijk kinderen en volwassenen. Alle gegevensverzameling zal worden ingevoerd in een anonieme database die demografische gegevens, anamnese, klinische en laboratoriumevaluatie, klinisch management en interventies bij opname en tijdens de follow-upperiode zal bevatten. Volwassenen en kinderen worden apart beoordeeld. Zodra de CMV-resultaten zijn verstrekt (WP4), worden risicofactoren geassocieerd met CMV-reactivering en ongunstige klinische resultaten, inclusief beide direct (d.w.z. pneumonitis, febriele episodes en hepatitis) en indirect geassocieerde (d.w.z. verlengd verblijf op de IC of mechanische beademing, en verhoogd aantal bacteriële infecties) zal worden onderzocht.

WP3 omvat de evaluatie van stress op basis van klinisch (WP3.1 en WP 3.2) en fundamenteel onderzoek (WP3.3). benadering. Biochemische stressmarkers zullen worden geëvalueerd bij opname en op dag 7 om de duur van stress te onderzoeken. Er zal rekening worden gehouden met gelijktijdige toediening van geneesmiddelen. Stressmarkers zullen worden gecorreleerd met CMV-reactivering en klinische uitkomst om te onderzoeken of ze kunnen worden gebruikt als identificeerbare risicofactoren voor toekomstig onderzoek. In WP3.3 zullen cellulaire signaleringsroutes van ontsteking in een subgroep van ons cohort bestudeerd worden. Specifiek zal de interactie van NFκΒ-activering en glucocorticoïdreceptorgevoeligheid in mononucleaire cellen van patiënten worden geëvalueerd en gecorreleerd met CMV-reactivering en uitkomst.

WP4 omvat de prospectieve detectie en kwantificering van CMV-DNA in verschillende biologische stalen. Alle gegevens zullen worden opgenomen in de hoofddatabase en, nog belangrijker, er zal een DNA-bank worden gevormd voor mogelijke detectie van andere herpesvirussen in de toekomst.

WP5 zal specifieke immuunresponsen op CMV evalueren in een subgroep van patiënten. Deze zullen worden gecorreleerd met de onderliggende ziekte, reactivering en stress. Bovendien zal een bank van supernatanten van die experimenten worden gevormd om in de toekomst cytokines (Luminex) te meten.