Reaktivering av CMV-infektion hos immunkompetenta patienter under svår stress (RECYSTRESS)

Detta är en multicenter prospektiv observationsstudie av CMV-seropositiva patienter (barn och vuxna) inlagda på ICU. Två pediatriska och fyra ICU-enheter för vuxna på högre utbildningssjukhus kommer att rekrytera under 48 respektive 36 månader.

Forskningsplan Vid inläggning på intensivvårdsavdelningen kommer patienter (grupp A och B) att screenas för inklusions-/exklusionskriterier och efter skriftligt informerat samtycke kommer patienten att skrivas in. Klinisk svårighetsgrad kommer att uppskattas med hjälp av standardiserade poängsystem (PRISM III respektive APACHI II). All relevant demografi, medicinsk historia, klinisk presentation och medicinska ingrepp kommer att föras in i en databas. Innan någon stödjande behandling (inotroper eller kortikosteroider) påbörjas kommer blod och saliv att tas för bestämning av biologiska markörer för stress. Serum och helblod kommer att samlas in för bestämning av CMV-IgG-antikroppar respektive CMV-DNA. CMV-seronegativa patienter kommer att uteslutas från ytterligare utvärdering. Seropositiva patienter kommer att följas prospektivt under 28 dagar. Veckouppföljning (7:e, 14:e, 21:e och 28:e dagen för sjukhusvistelse) kommer att omfatta: klinisk utvärdering och laboratorieutvärdering, dokumentation av terapeutisk intervention och CMV-reaktiveringsbedömning (CMV-DNA-detektering). Stressmarkörer kommer att undersökas igen endast dag 7. Dag 28 (slutet av uppföljningen) kommer det kliniska resultatet att registreras.

I en slumpmässig undergrupp av patienter (20 barn och 20 vuxna) kommer den intracellulära signalvägen för inflammation och specifika immunsvar att studeras.

Laboratoriemetoder

A) Serologi för CMV: Serum CMV-IgG-antikroppar kommer att mätas med enzymimmunoanalysmetoden (Elisa, Abbott Laboratories) i sjukhusserologiska laboratorier.

B) Uppskattning av biologiska stressindikatorer

B.1. Mätning av fritt kortisol. Salivprover kommer att samlas in tre gånger om dagen (08.00, 14.00 och 20.00) för att bestämma den dygnsrytmiska kortisolsekretionen med hjälp av speciella syntetiska pinnar (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) och förvaras vid -70oC. Kortisolnivåer kommer att bestämmas med elektrokemiluminescensimmunanalys (Elecsys Cortisol reagent kit, ROCHE).

B.2. Plasma katekolaminer. Katekolaminnivåer (noradrenalin, adrenalin och dopamin) kommer att mätas innan behandlingen påbörjas med något inotropiskt medel. Prover kommer att tas från en venkateter med patienten liggande endast hos patienter som inte får inotroper. Plasma kommer att lagras vid -85oC. Den omvända vätske-HPLC-fasen (High Performance Liquid Chromatography - omvänd fas) kommer att användas.

B.3. Serum-TNF-a kommer att mätas med kvantitativ sandwich-enzymimmunanalysmetod (Elecsys, ROCHE).

C) Detektion och kvantifiering av CMV-DNA från helblod och bronkoalveolär lavage (BAL, hos ventilerade patienter). Om en patient skrivs ut före dag 28, kommer saliveter att ges hemma för att samla saliv för CMV-DNA-bestämning (förvaras i hemkylen) och returneras dag 28. Prover kommer att förvaras vid -70oC och alla prover från varje patient kommer att undersökas samtidigt. DNA-extraktion och realtids-PCR kommer att utföras av kommersiella kit (Nanogen Advanced Diagnostics). En genregion som kodar för Major Immediate Early Antigen (MIEA) av CMV kommer att detekteras. Alla PCR-tester kommer att utföras vid Cytology Laboratory, Attikon University Hospital, Aten, Grekland (docent P. Karakitsos).

D) Mätningar av glukokortikoidreceptor (GR) och nukleär faktor κB (NFκB) i helcells- och kärnextrakt från perifera blodlymfocyter kommer att utföras genom immunblotting vid Institutionen för biologisk kemi, Atens universitet (Ass. Prof P. Moutsatsou)8

E) Specifik immunrespons mot CMV. Specifika immunsvar av CD4+ och CD8+ T-lymfocyter från perifert blod efter in vitro-stimulering med CMV-polypeptider (inklusive pp65-antigen) kommer att studeras med intracellulär färgning (Intracellulär färgning, ICS). Proliferationen av CD4+ (CFSE) och cytotoxiciteten av CD8+ (perforin och granzym B) kommer att bedömas.

Statistisk analys För dataanalysen kommer vuxna och barn att undersökas separat. Seropositiva patienter utan CMV-reaktivering kommer att användas som kontrollgrupp. Ett p-värde (p) på ≤0,05 är kriteriet för statistisk signifikans. T-test och chi-kvadrattest kommer att användas för kvantitativ och kvalitativ analys, medan Mantel-Haenzel-metoden kommer att användas för att beräkna relativ risk för olika utfall (dödlighet, intubation, etc) mellan de två grupperna. För att identifiera potentiella riskfaktorer förknippade med CMV-reaktivering och kliniskt utfall kommer logistisk regressionsanalys med hjälp av statistikprogrammet SAS v.9 att utföras.

Provberäkning För att beräkna storleken på studiens urval användes statistikprogrammet EpiInfo version 6. Baserat på färska data från vuxna kan 30 % uppvisa CMV-reaktivering när de är på intensivvårdsavdelningen. Dödligheten på intensivvården för barn och vuxna har uppskattats till cirka 8 % respektive 63 %. Nya data tyder på att CMV-reaktivering är associerad med ökad mortalitet (RR=1,93) och morbiditet (RR=5,70). Urvalsstorleken beräknades för att uppfylla kriterierna för 99 % konfidensintervall och 90 % statistisk styrka. Vi uppskattade att vår CMV(+)-population skulle omfatta 165 barn och 109 vuxna.

Arbetspaket WP1 och WP2 involverar klinisk forskning; inskrivning och klinisk uppföljning av barn respektive vuxna. All datainsamling kommer att föras in i en anonym databas som kommer att innehålla demografiska data, tidigare historia, klinisk utvärdering och laboratorieutvärdering, klinisk hantering och interventioner vid intagning och under uppföljningsperioden. Vuxna och barn kommer att utvärderas separat. När CMV-resultat har tillhandahållits (WP4), riskfaktorer förknippade med CMV-reaktivering såväl som negativa kliniska resultat, inklusive båda de direkt (dvs. pneumonit, feberepisoder och hepatit) och indirekt associerade (dvs. förlängd intensivvårdsvistelse eller mekanisk ventilation och ökad frekvens av bakteriella infektioner) kommer att undersökas.

WP3 innebär utvärdering av stress från en klinisk (WP3.1 och WP 3.2) och grundforskning (WP3.3) närma sig. Biokemiska stressmarkörer kommer att utvärderas vid intagning och dag 7 för att undersöka stressens varaktighet. Samtidig administrering av läkemedel kommer att beaktas. Stressmarkörer kommer att korreleras med CMV-reaktivering och kliniskt utfall för att undersöka om de kan användas som identifierbara riskfaktorer för framtida forskning. I WP3.3 kommer cellulära signalvägar för inflammation i en undergrupp av vår kohort att studeras. Specifikt kommer interaktionen av NFκΒ-aktivering och glukokortikoidreceptorkänslighet i patienternas mononukleära celler att utvärderas och korreleras med CMV-reaktivering och utfall.

WP4 involverar prospektiv detektering och kvantifiering av CMV-DNA i olika biologiska prover. All data kommer att ingå i huvuddatabasen och ännu viktigare kommer en DNA-bank att bildas för eventuell upptäckt av andra herpesvirus i framtiden.

WP5 kommer att utvärdera specifika immunsvar mot CMV hos en undergrupp av patienter. Dessa kommer att vara korrelerade med den underliggande sjukdomen, reaktivering och stress. Dessutom kommer en bank av supernatanter från dessa experiment att bildas för att mäta cytokiner (Luminex) i framtiden.