CMV-infektion uudelleenaktivointi immunokompetenteilla potilailla vakavassa stressissä (RECYSTRESS)

Tämä on monikeskus-prospektiivinen havainnointitutkimus CMV-seropositiivisista potilaista (lapset ja aikuiset), jotka on otettu teho-osastolle. Kaksi lasten ja neljä aikuisten teho-osastoa korkea-asteen opetussairaaloissa rekrytoidaan 48 ja 36 kuukaudeksi.

Tutkimussuunnitelma Tehohoitoon tultuaan potilaat (ryhmät A ja B) seulotaan mukaanotto-/poissulkemiskriteerien suhteen ja kirjallisen tietoisen suostumuksen saatuaan potilas otetaan mukaan. Kliininen vakavuus arvioidaan käyttämällä standardoituja pisteytysjärjestelmiä (PRISM III ja APACHI II, vastaavasti). Kaikki asiaankuuluvat demografiset, sairaushistoriat, kliiniset esitykset ja lääketieteelliset toimenpiteet tallennetaan tietokantaan. Ennen tukihoidon aloittamista (inotroopit tai kortikosteroidit) otetaan verta ja sylkeä stressin biologisten merkkiaineiden määrittämiseksi. Seerumi ja kokoveri kerätään CMV-IgG-vasta-aineiden ja vastaavasti CMV-DNA:n määrittämistä varten. CMV-seronegatiiviset potilaat jätetään lisäarvioinnin ulkopuolelle. Seropositiivisia potilaita seurataan prospektiivisesti 28 päivän ajan. Viikoittainen seuranta (7., 14., 21. ja 28. sairaalahoitopäivä) sisältää: kliinisen ja laboratorioarvioinnin, terapeuttisen toimenpiteen dokumentoinnin ja CMV-reaktivaation arvioinnin (CMV-DNA-detektio). Stressimarkkerit tutkitaan uudelleen vain päivänä 7. Päivänä 28 (seurannan lopussa) kliininen tulos kirjataan.

Satunnaisessa potilaiden alajoukossa (20 lasta ja 20 aikuista) tutkitaan tulehduksen solunsisäistä signalointireittiä ja spesifisiä immuunivasteita.

Laboratoriomenetelmät

A) Serologia CMV:lle: Seerumin CMV-IgG-vasta-aineet mitataan Enzyme Immunoassay Methodilla (Elisa, Abbott Laboratories) sairaalan serologialaboratoriossa.

B) Biologisten stressiindikaattoreiden arviointi

B.1. Vapaan kortisolin mittaus. Sylkinäytteet otetaan kolme kertaa päivässä (8.00, 14.00 ja 20.00) vuorokausirytmin kortisolinerityksen määrittämiseksi käyttämällä erityisiä synteettisiä vanupuikkoja (Salivetta-Salivette, Sarsted®) ja säilytetään -70 oC:ssa. Kortisolitasot määritetään elektrokemiluminesenssi-immunomäärityksellä (Elecsys Cortisol reagent kit, ROCHE).

B.2. Plasman katekoliamiinit. Katekoliamiinitasot (noradrenaliini, adrenaliini ja dopamiini) mitataan ennen hoidon aloittamista millä tahansa inotrooppisella aineella. Näytteet otetaan laskimokatetrista potilaan ollessa makuuasennossa vain potilailta, jotka eivät saa inotrooppisia lääkkeitä. Plasma säilytetään -85 oC:ssa. Neste-HPLC-käänteisfaasia (High Performance Liquid Chromatography - käänteisfaasi) käytetään.

B.3. Seerumin TNF-a mitataan kvantitatiivisella kerrosentsyymi-immunomääritysmenetelmällä (Elecsys, ROCHE).

C) CMV-DNA:n havaitseminen ja kvantifiointi kokoverestä ja bronkoalveolaarisesta huuhtelusta (BAL, ventiloiduilla potilailla). Jos potilas kotiutetaan ennen päivää 28, sylvetit annetaan kotiin syljen keräämiseksi CMV-DNA-määritystä varten (säilytetään kotijääkaapissa) ja palautetaan 28. päivänä. Näytteet säilytetään -70 oC:ssa ja kaikki näytteet jokaisesta potilaasta tutkitaan samanaikaisesti. DNA-uutto ja reaaliaikainen PCR suoritetaan kaupallisilla sarjoilla (Nanogen Advanced Diagnostics). CMV:n suurta välitöntä varhaista antigeeniä (MIEA) koodaava geenialue havaitaan. Kaikki PCR-testit suoritetaan Sytology Laboratoryssa, Attikon University Hospital, Ateena, Kreikka (associate Prof P. Karakitsos).

D) Glukokortikoidireseptorin (GR) ja ydintekijän κB (NFkB) mittaukset perifeerisen veren lymfosyyttien kokosoluista ja tumauutteista suoritetaan immunoblottauksella Ateenan yliopiston biologisen kemian laitoksella (Ass. Prof P. Moutsatsu)8

E) Spesifinen immuunivaste CMV:tä vastaan. CD4+- ja CD8+-T-lymfosyyttien spesifisiä immuunivasteita perifeerisestä verestä CMV-polypeptideillä (mukaan lukien pp65-antigeeni) tehdyn in vitro -stimulaation jälkeen tutkitaan solunsisäisellä värjäyksellä (Intracellular Staining, ICS). CD4+:n (CFSE) lisääntyminen ja CD8+:n (perforiini ja grantsyymi B) sytotoksisuus arvioidaan.

Tilastollinen analyysi Aineiston analysointia varten tarkastellaan erikseen aikuisia ja lapsia. Verrokkiryhmänä käytetään seropositiivisia potilaita, joilla ei ole CMV-reaktivaatiota. P-arvo (p) ≤0,05 on tilastollisen merkitsevyyden kriteeri. T-testiä ja khin neliötestiä käytetään kvantitatiiviseen ja kvalitatiiviseen analyysiin, kun taas Mantel-Haenzelin menetelmää käytetään laskemaan suhteellinen riski erilaisten tulosten (kuolleisuus, intubaatio jne.) välillä näiden kahden ryhmän välillä. CMV:n uudelleenaktivoitumiseen ja kliiniseen lopputulokseen liittyvien mahdollisten riskitekijöiden tunnistamiseksi suoritetaan logistinen regressioanalyysi käyttämällä tilastoohjelmaa SAS v.9.

Otoslaskenta Tutkimusotoskoon laskemiseen käytettiin tilasto-ohjelman EpiInfo versiota 6. Viimeaikaisten aikuisilta saatujen tietojen perusteella 30 % voi osoittaa CMV:n uudelleenaktivoitumisen teho-osastolla. Kuolleisuuden lasten teho-osastolla on arvioitu olevan noin 8 % ja aikuisten teho-osastolla 63 %. Viimeaikaiset tiedot viittaavat siihen, että CMV:n uudelleenaktivoituminen liittyy lisääntyneeseen kuolleisuuteen (RR=1,93) ja sairastuvuuteen (RR=5,70). Otoskoon laskettiin täyttävän 99 %:n luottamusvälin ja 90 %:n tilastollisen tehon kriteerit. Arvioimme, että CMV(+)-populaatiossamme pitäisi olla 165 lasta ja 109 aikuista.

Työpaketit WP1 ja WP2 sisältävät kliinistä tutkimusta; lasten ja aikuisten kliininen seuranta. Kaikki tiedonkeruu tallennetaan anonyymiin tietokantaan, joka sisältää demografiset tiedot, historian, kliinisen ja laboratorioarvioinnin, kliinisen hoidon ja interventiot sisäänpääsyn ja seurantajakson aikana. Aikuiset ja lapset arvostellaan erikseen. Kun CMV-tulokset on toimitettu (WP4), CMV-reaktivaatioon liittyvät riskitekijät sekä haitalliset kliiniset tulokset, mukaan lukien molemmat suoraan (ts. pneumoniitti, kuumejaksot ja hepatiitti) ja epäsuorasti (esim. pidennetty tehohoitojakso tai koneellinen ventilaatio ja lisääntynyt bakteeri-infektioiden määrä) tutkitaan.

WP3 sisältää stressin arvioinnin kliinisestä (WP3.1 ja WP 3.2) ja perustutkimuksesta (WP3.3) lähestyä. Biokemialliset stressimarkkerit arvioidaan saapumisen yhteydessä ja päivänä 7 stressin keston tutkimiseksi. Samanaikainen lääkkeiden anto otetaan huomioon. Stressimarkkereita korreloidaan CMV-reaktivaation ja kliinisen tuloksen kanssa, jotta voidaan selvittää, voidaanko niitä käyttää tunnistettavissa olevina riskitekijöinä tulevassa tutkimuksessa. WP3.3:ssa tutkitaan tulehduksen solujen signalointireittejä kohorttimme alajoukossa. Erityisesti NFkΒ-aktivaation ja glukokortikoidireseptorin herkkyyden vuorovaikutusta potilaiden mononukleaarisissa soluissa arvioidaan ja se korreloidaan CMV-reaktivaation ja tuloksen kanssa.

WP4 sisältää CMV-DNA:n prospektiivisen havaitsemisen ja kvantifioinnin erilaisissa biologisissa näytteissä. Kaikki tiedot sisällytetään päätietokantaan ja mikä tärkeintä, muodostetaan DNA-pankki muiden herpesvirusten mahdollista havaitsemista varten tulevaisuudessa.

WP5 arvioi spesifiset immuunivasteet CMV:lle potilaiden alajoukossa. Nämä korreloivat taustalla olevaan sairauteen, uudelleenaktivoitumiseen ja stressiin. Lisäksi näistä kokeista muodostetaan supernatanttipankki sytokiinien (Luminex) mittaamiseksi tulevaisuudessa.