Reativação da Infecção por CMV em Pacientes Imunocompetentes Sob Estresse Grave (RECYSTRESS)

Este é um estudo observacional prospectivo multicêntrico de pacientes soropositivos para CMV (crianças e adultos) internados em UTI. Duas unidades de UTI pediátrica e quatro de adultos em hospitais universitários terciários serão recrutadas por 48 e 36 meses, respectivamente.

Plano de pesquisa Após a admissão na UTI, os pacientes (grupos A e B) serão triados quanto aos critérios de inclusão/exclusão e, após a obtenção do consentimento informado por escrito, o paciente será inscrito. A gravidade clínica será estimada usando sistemas de pontuação padronizados (PRISM III e APACHI II, respectivamente). Todos os dados demográficos, histórico médico, apresentação clínica e intervenções médicas pertinentes serão inseridos em um banco de dados. Antes de iniciar qualquer tratamento de suporte (inotrópicos ou corticosteróides), sangue e saliva serão obtidos para a determinação de marcadores biológicos de estresse. Soro e sangue total serão coletados para determinação de anticorpos CMV-IgG e CMV-DNA, respectivamente. Pacientes soronegativos para CMV serão excluídos da avaliação posterior. Os pacientes soropositivos serão acompanhados prospectivamente por 28 dias. O seguimento semanal (7º, 14º, 21º e 28º dia de internamento) incluirá: avaliação clínica e laboratorial, documentação da intervenção terapêutica e avaliação da reativação do CMV (deteção do CMV-DNA). Os marcadores de estresse serão reexaminados apenas no dia 7. No dia 28 (final do acompanhamento), o resultado clínico será registrado.

Num subconjunto aleatório de doentes (20 crianças e 20 adultos) serão estudadas as vias de sinalização intracelular da inflamação e as respostas imunitárias específicas.

Métodos de Laboratório

A) Sorologia para CMV: Os anticorpos séricos CMV-IgG serão medidos pelo método de imunoensaio enzimático (Elisa, Abbott Laboratories) no laboratório de sorologia do hospital.

B) Estimativa de indicadores de estresse biológico

B.1. Medição do cortisol livre. Amostras de saliva serão coletadas três vezes ao dia (8h, 14h e 20h) para determinação do padrão circadiano de secreção de cortisol por meio de swabs sintéticos especiais (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) e armazenadas a -70oC. Os níveis de cortisol serão determinados com imunoensaio de eletroquimioluminescência (Elecsys Cortisol reagente kit, ROCHE).

B.2. Catecolaminas plasmáticas. Os níveis de catecolaminas (noradrenalina, adrenalina e dopamina) serão medidos antes do início da terapia com qualquer agente inotrópico. As amostras serão coletadas de um cateter venoso com o paciente em decúbito dorsal apenas em pacientes que não receberam inotrópicos. O plasma será armazenado a -85oC. Será utilizada a fase reversa de HPLC Líquido (High Performance Liquid Chromatography - reverse phase).

B.3. O TNF-a sérico será dosado pelo método quantitativo-sanduíche de imunoensaio enzimático (Elecsys, ROCHE).

C) Detecção e quantificação de CMV-DNA de sangue total e lavado broncoalveolar (BAL, em pacientes ventilados). Se um paciente receber alta antes do dia 28, serão dadas salivetas em casa para coletar saliva para determinação de CMV-DNA (armazenadas na geladeira de casa) e devolvidas no dia 28. As amostras serão armazenadas a -70oC e todas as amostras de cada paciente serão examinadas ao mesmo tempo. A extração de DNA e a PCR em tempo real serão realizadas por kits comerciais (Nanogen Advanced Diagnostics). Será detectada uma região do gene que codifica o Major Immediate Early Antigen (MIEA) do CMV. Todos os testes de PCR serão realizados no Laboratório de Citologia, Attikon University Hospital, Atenas, Grécia (Professor Associado P. Karakitsos).

D) Medições do receptor de glicocorticóide (GR) e do fator nuclear κB (NFκB) em células inteiras e extratos nucleares de linfócitos do sangue periférico serão realizadas por imunotransferência no Departamento de Química Biológica da Universidade de Atenas (Ass. Prof P. Moutsatsou)8

E) Resposta imune específica contra o CMV. Respostas imunes específicas de linfócitos T CD4+ e CD8+ de sangue periférico após estimulação in vitro com polipeptídeos de CMV (incluindo o antígeno pp65) serão estudadas com coloração intracelular (Intracellular staining, ICS). A proliferação de CD4+ (CFSE) e a citotoxicidade de CD8+ (perforina e granzima B) serão avaliadas.

Análise estatística Para a análise dos dados adultos e crianças serão examinados separadamente. Pacientes soropositivos sem reativação do CMV serão usados ​​como grupo controle. Um p-valor (p) de ≤0,05 é o critério de significância estatística. Os testes t e qui-quadrado serão usados ​​para análise quantitativa e qualitativa, enquanto o método de Mantel-Haenzel será usado para calcular o risco relativo de diferentes desfechos (mortalidade, intubação etc.) entre os dois grupos. Para identificar potenciais fatores de risco associados à reativação do CMV e evolução clínica, será realizada análise de regressão logística utilizando o programa estatístico SAS v.9.

Cálculo da amostra Para calcular o tamanho da amostra do estudo foi utilizado o programa estatístico EpiInfo versão 6. Com base em dados recentes de adultos, 30% podem demonstrar reativação do CMV durante a internação na UTI. A taxa de mortalidade na UTI pediátrica e adulta foi estimada em aproximadamente 8% e 63%, respectivamente. Dados recentes sugerem que a reativação do CMV está associada ao aumento da mortalidade (RR=1,93) e morbidade (RR=5,70). O tamanho da amostra foi calculado para atender aos critérios de intervalo de confiança de 99% e poder estatístico de 90%. Estimamos que nossa população de CMV(+) deveria incluir 165 crianças e 109 adultos.

Os pacotes de trabalho WP1 e WP2 envolvem pesquisa clínica; inscrição e acompanhamento clínico de crianças e adultos, respectivamente. Toda a coleta de dados será inserida em um banco de dados anônimo que incluirá dados demográficos, histórico, avaliação clínica e laboratorial, manejo clínico e intervenções na admissão e durante o período de acompanhamento. Adultos e crianças serão avaliados separadamente. Uma vez que os resultados do CMV são fornecidos (WP4), os fatores de risco associados à reativação do CMV, bem como os resultados clínicos adversos, incluindo aqueles diretamente (ou seja, pneumonite, episódios febris e hepatite) e indiretamente associados (i.e. permanência prolongada na UTI ou ventilação mecânica e aumento da taxa de infecções bacterianas) serão examinados.

WP3 envolve a avaliação do estresse de uma pesquisa clínica (WP3.1 e WP 3.2) e básica (WP3.3) abordagem. Marcadores bioquímicos de estresse serão avaliados na admissão e no dia 7 para examinar a duração do estresse. A administração concomitante de medicamentos será levada em consideração. Os marcadores de estresse serão correlacionados com a reativação do CMV e o resultado clínico para examinar se eles podem ser usados ​​como fatores de risco identificáveis ​​para pesquisas futuras. Em WP3.3 serão estudadas as vias de sinalização celular da inflamação em um subconjunto de nossa coorte. Especificamente, a interação da ativação do NFκΒ e a sensibilidade do receptor de glicocorticóide nas células mononucleares dos pacientes será avaliada e correlacionada com a reativação e desfecho do CMV.

WP4 envolve a detecção prospectiva e quantificação de CMV-DNA em diferentes amostras biológicas. Todos os dados serão incluídos no banco de dados principal e, mais importante, um banco de DNA será formado para possível detecção de outros herpesvírus no futuro.

O WP5 avaliará respostas imunes específicas ao CMV em um subconjunto de pacientes. Estes serão correlacionados com a doença de base, reativação e estresse. Além disso, um banco de sobrenadantes desses experimentos será formado para medir citocinas (Luminex) no futuro.