Реактивация ЦМВ-инфекции у иммунокомпетентных больных в условиях тяжелого стресса (RECYSTRESS)

Это многоцентровое проспективное обсервационное исследование ЦМВ-серопозитивных пациентов (детей и взрослых), госпитализированных в ОИТ. Два педиатрических и четыре отделения интенсивной терапии для взрослых в учебных больницах третичного уровня будут набраны на 48 и 36 месяцев соответственно.

План исследования При поступлении в отделение интенсивной терапии пациенты (группы А и В) будут проверены на соответствие критериям включения/исключения, и после получения письменного информированного согласия пациент будет включен в исследование. Клиническая тяжесть будет оцениваться с использованием стандартных систем оценки (PRISM III и APACHI II соответственно). Все соответствующие демографические данные, история болезни, клинические проявления и медицинские вмешательства будут внесены в базу данных. Перед началом любого поддерживающего лечения (инотропы или кортикостероиды) кровь и слюна будут получены для определения биологических маркеров стресса. Сыворотка и цельная кровь будут собираться для определения антител CMV-IgG и ДНК CMV-ДНК соответственно. CMV-серонегативные пациенты будут исключены из дальнейшей оценки. Серопозитивные пациенты будут наблюдаться проспективно в течение 28 дней. Еженедельное наблюдение (7-й, 14-й, 21-й и 28-й день госпитализации) будет включать: клиническое и лабораторное обследование, документирование терапевтического вмешательства и оценку реактивации ЦМВ (обнаружение ЦМВ-ДНК). Маркеры стресса будут повторно исследованы только на 7-й день. На 28-й день (конец наблюдения) будет зарегистрирован клинический результат.

В случайной подгруппе пациентов (20 детей и 20 взрослых) будут изучены внутриклеточные сигнальные пути воспаления и специфические иммунные реакции.

Лабораторные методы

А) Серология на ЦМВ: Сывороточные антитела к ЦМВ-IgG будут измеряться методом иммуноферментного анализа (ELisa, Abbott Laboratories) в серологической лаборатории больницы.

Б) Оценка показателей биологического стресса

Б.1. Измерение свободного кортизола. Образцы слюны будут собираться три раза в день (8:00, 14:00 и 20:00) для определения циркадного характера секреции кортизола с использованием специальных синтетических тампонов (Salivetta-Salivette, Sarsted®) и храниться при -70oC. Уровни кортизола будут определяться с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа (набор реагентов Elecsys Cortisol, ROCHE).

БИ 2. Катехоламины плазмы. Уровни катехоламинов (норадреналина, адреналина и дофамина) будут измеряться до начала терапии любым инотропным средством. Образцы будут браться из венозного катетера в положении пациента на спине только у пациентов, не получающих инотропные препараты. Плазма будет храниться при температуре -85oC. Будет использоваться обращенная фаза жидкостной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография - обращенная фаза).

Б.3. Уровень TNF-α в сыворотке будет измеряться с помощью метода количественного сэндвич-ферментного иммуноанализа (Elecsys, ROCHE).

C) Обнаружение и количественное определение ЦМВ-ДНК из цельной крови и бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ, у пациентов на ИВЛ). Если пациент выписан до 28-го дня, слюнные железы будут сданы на дому для сбора слюны для определения ЦМВ-ДНК (хранятся в домашнем холодильнике) и возвращены на 28-й день. Образцы будут храниться при температуре -70°C, и все образцы от каждого пациента будут исследованы одновременно. Выделение ДНК и ПЦР в реальном времени будут проводиться с помощью коммерческих наборов (Nanogen Advanced Diagnostics). Будет обнаружен участок гена, кодирующий главный немедленный ранний антиген (MIEA) ЦМВ. Все ПЦР-тесты будут проводиться в лаборатории цитологии Университетской больницы Аттикон, Афины, Греция (доцент П. Каракитсос).

D) Измерения глюкокортикоидного рецептора (GR) и ядерного фактора κB (NFκB) в цельных клетках и ядерных экстрактах из лимфоцитов периферической крови будут выполняться с помощью иммуноблоттинга на кафедре биологической химии Афинского университета (доц. проф. П. Муцацу)8

Д) Специфический иммунный ответ против ЦМВ. Специфические иммунные ответы CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов периферической крови после стимуляции in vitro полипептидами ЦМВ (включая антиген pp65) будут изучаться с помощью внутриклеточного окрашивания (Intracellular staining, ICS). Будут оцениваться пролиферация CD4+ (CFSE) и цитотоксичность CD8+ (перфорин и гранзим B).

Статистический анализ Для анализа данных взрослые и дети будут обследованы отдельно. В качестве контрольной группы будут использоваться серопозитивные пациенты без реактивации ЦМВ. Значение p (p) ≤0,05 является критерием статистической значимости. Т-тест и критерий хи-квадрат будут использоваться для количественного и качественного анализа, а метод Мантеля-Генцеля будет использоваться для расчета относительного риска различных исходов (смертность, интубация и т. д.) между двумя группами. Для выявления потенциальных факторов риска, связанных с реактивацией ЦМВ и клиническим исходом, будет проведен логистический регрессионный анализ с использованием статистической программы SAS v.9.

Расчет выборки Для расчета размера выборки исследования использовалась статистическая программа EpiInfo версии 6. Основываясь на недавних данных о взрослых, у 30% может наблюдаться реактивация ЦМВ в отделении интенсивной терапии. По оценкам, уровень смертности в педиатрических и взрослых отделениях интенсивной терапии достигает примерно 8% и 63% соответственно. Последние данные свидетельствуют о том, что реактивация ЦМВ связана с повышенной смертностью (ОР=1,93) и заболеваемостью (ОР=5,70). Размер выборки рассчитывался так, чтобы соответствовать критериям 99% доверительного интервала и 90% статистической мощности. По нашим оценкам, наша популяция ЦМВ(+) должна включать 165 детей и 109 взрослых.

Рабочие пакеты WP1 и WP2 включают клинические исследования; регистрация и клиническое наблюдение за детьми и взрослыми соответственно. Все собранные данные будут внесены в анонимную базу данных, которая будет включать демографические данные, историю болезни, клиническую и лабораторную оценку, клиническое ведение и вмешательства при поступлении и в течение периода наблюдения. Взрослые и дети оцениваются отдельно. После предоставления результатов ЦМВ (WP4) факторы риска, связанные с реактивацией ЦМВ, а также неблагоприятные клинические исходы, в том числе непосредственно (т. пневмонит, лихорадочные эпизоды и гепатит) и косвенно связанные (т.е. длительное пребывание в отделении интенсивной терапии или искусственная вентиляция легких, а также повышенный уровень бактериальных инфекций) будут обследованы.

WP3 включает оценку стресса на основе клинических (WP3.1 и WP 3.2) и фундаментальных исследований (WP3.3). подход. Маркеры биохимического стресса будут оцениваться при поступлении и на 7-й день для изучения продолжительности стресса. Учитывается одновременное введение препарата. Маркеры стресса будут коррелировать с реактивацией ЦМВ и клиническим исходом, чтобы выяснить, можно ли их использовать в качестве идентифицируемых факторов риска для будущих исследований. В WP3.3 будут изучены клеточные сигнальные пути воспаления в подмножестве нашей когорты. В частности, взаимодействие активации NFκB и чувствительности глюкокортикоидных рецепторов в мононуклеарных клетках пациентов будет оцениваться и коррелироваться с реактивацией ЦМВ и исходом.

WP4 включает проспективное обнаружение и количественную оценку ДНК ЦМВ в различных биологических образцах. Все данные будут включены в основную базу данных и, что более важно, будет сформирован банк ДНК для возможного выявления других герпесвирусов в будущем.

WP5 будет оценивать специфические иммунные реакции на ЦМВ у подгруппы пациентов. Они будут коррелировать с основным заболеванием, реактивацией и стрессом. Кроме того, в будущем будет сформирован банк супернатантов из этих экспериментов для измерения цитокинов (Luminex).