Reaktivace CMV infekce u imunokompetentních pacientů pod silným stresem (RECYSTRESS)

Jedná se o multicentrickou prospektivní observační studii CMV séropozitivních pacientů (dětí a dospělých) přijatých na JIP. Dvě dětské a čtyři oddělení JIP pro dospělé v terciárních fakultních nemocnicích budou nabírat na 48 a 36 měsíců.

Plán výzkumu Po přijetí na JIP budou pacienti (skupina A a B) podrobeni screeningu na kritéria zařazení/vyloučení a po obdržení písemného informovaného souhlasu bude pacient zařazen. Klinická závažnost bude odhadnuta pomocí standardizovaných systémů skóre (PRISM III a APACHI II v tomto pořadí). Všechny příslušné demografické údaje, anamnéza, klinický obraz a lékařské zákroky budou vloženy do databáze. Před zahájením jakékoli podpůrné léčby (inotropy nebo kortikosteroidy) bude odebrána krev a sliny pro stanovení biologických markerů stresu. Pro stanovení CMV-IgG protilátek a CMV-DNA bude odebráno sérum a plná krev. CMV séronegativní pacienti budou z dalšího hodnocení vyloučeni. Séropozitivní pacienti budou prospektivně sledováni po dobu 28 dnů. Týdenní sledování (7., 14., 21. a 28. den hospitalizace) bude zahrnovat: klinické a laboratorní vyšetření, dokumentaci terapeutické intervence a posouzení reaktivace CMV (detekce CMV-DNA). Markery stresu budou znovu vyšetřeny pouze v den 7. V den 28 (konec sledování) bude zaznamenán klinický výsledek.

U náhodné podskupiny pacientů (20 dětí a 20 dospělých) bude studována intracelulární signální dráha zánětu a specifické imunitní odpovědi.

Laboratorní metody

A) Sérologie CMV: Protilátky CMV-IgG v séru budou měřeny metodou enzymové imunoanalýzy (Elisa, Abbott Laboratories) v nemocniční sérologické laboratoři.

B) Odhad indikátorů biologického stresu

B.1. Měření volného kortizolu. Vzorky slin budou odebírány třikrát denně (8:00, 14:00 a 20:00) za účelem stanovení cirkadiánního vzoru sekrece kortizolu pomocí speciálních syntetických tampónů (Salivetta-Salivette, Sarsted®) a skladovány při -70oC. Hladiny kortizolu budou stanoveny pomocí elektrochemiluminiscenčního imunotestu (Elecsys Cortisol reagent kit, ROCHE).

B.2. Plazmatické katecholaminy. Hladiny katecholaminů (noradrenalin, adrenalin a dopamin) budou měřeny před zahájením léčby jakýmkoli inotropním přípravkem. Vzorky budou odebírány z venózního katétru s pacientem vleže pouze u pacientů, kteří nedostávají inotropy. Plazma bude skladována při -85oC. Bude použita reverzní fáze kapalinové HPLC (High Performance Liquid Chromatography - reverzní fáze).

B.3. Sérový TNF-a bude měřen metodou kvantitativní sendvičové enzymové imunoanalýzy (Elecsys, ROCHE).

C) Detekce a kvantifikace CMV-DNA z plné krve a bronchoalveolární laváže (BAL, u ventilovaných pacientů). Pokud je pacient propuštěn před 28. dnem, budou mu doma podány sliny k odběru slin pro stanovení CMV-DNA (uložené v domácí lednici) a 28. den budou vráceny. Vzorky budou skladovány při -70oC a všechny vzorky od každého pacienta budou vyšetřeny současně. Extrakce DNA a real-time PCR budou prováděny komerčními soupravami (Nanogen Advanced Diagnostics). Bude detekována oblast genu kódující hlavní okamžitý časný antigen (MIEA) CMV. Veškeré PCR testování bude provedeno v Cytologické laboratoři, Attikon University Hospital, Atény Řecko (doc. Prof. P. Karakitsos).

D) Měření glukokortikoidního receptoru (GR) a nukleárního faktoru κB (NFκB) v celobuněčných a jaderných extraktech z lymfocytů periferní krve bude provedeno imunoblotováním na Katedře biologické chemie Univerzity v Aténách (doc. Prof P. Moutsatsou)8

E) Specifická imunitní odpověď proti CMV. Specifické imunitní odpovědi CD4+ a CD8+ T lymfocytů z periferní krve po in vitro stimulaci CMV polypeptidy (včetně antigenu pp65) budou studovány s intracelulárním barvením (Intracelulární barvení, ICS). Bude hodnocena proliferace CD4+ (CFSE) a cytotoxicita CD8+ (perforin a granzym B).

Statistická analýza Pro analýzu dat budou zvlášť vyšetřeni dospělí a děti. Séropozitivní pacienti bez reaktivace CMV budou použity jako kontrolní skupina. Kritériem statistické významnosti je p-hodnota (p) ≤0,05. T-test a chí-kvadrát test budou použity pro kvantitativní a kvalitativní analýzu, zatímco Mantel-Haenzelova metoda bude použita pro výpočet relativního rizika různých výsledků (úmrtnost, intubace atd.) mezi těmito dvěma skupinami. K identifikaci potenciálních rizikových faktorů spojených s reaktivací CMV a klinickým výsledkem bude provedena logistická regresní analýza pomocí statistického programu SAS v.9.

Výpočet vzorku Pro výpočet velikosti studijního vzorku byl použit statistický program EpiInfo verze 6. Na základě nedávných údajů od dospělých může 30 % vykazovat reaktivaci CMV na JIP. Úmrtnost na JIP pro děti a dospělé se odhaduje na přibližně 8 % a 63 %. Nedávné údaje naznačují, že reaktivace CMV je spojena se zvýšenou mortalitou (RR=1,93) a morbiditou (RR=5,70). Velikost vzorku byla vypočtena tak, aby splňovala kritéria 99% intervalu spolehlivosti a 90% statistické síly. Odhadli jsme, že naše populace CMV(+) by měla zahrnovat 165 dětí a 109 dospělých.

Pracovní balíčky WP1 a WP2 zahrnují klinický výzkum; zápis a klinické sledování dětí a dospělých. Všechna shromažďovaná data budou zanesena do anonymní databáze, která bude zahrnovat demografická data, minulost, klinické a laboratorní hodnocení, klinický management a intervence při přijetí a během období sledování. Dospělí a děti budou hodnoceni zvlášť. Jakmile jsou poskytnuty výsledky CMV (WP4), rizikové faktory spojené s reaktivací CMV, stejně jako nepříznivé klinické výsledky, včetně těch přímých (tj. pneumonitida, febrilní epizody a hepatitida) a nepřímo související (tj. prodloužený pobyt na JIP nebo mechanická ventilace a zvýšený výskyt bakteriálních infekcí).

WP3 zahrnuje hodnocení stresu z klinického (WP3.1 a WP 3.2) a základního výzkumu (WP3.3) přístup. Biochemické markery stresu budou hodnoceny při přijetí a 7. den, aby se zjistilo trvání stresu. Bude zohledněno současné podávání léků. Markery stresu budou korelovány s reaktivací CMV a klinickým výsledkem, aby se prozkoumalo, zda je lze použít jako identifikovatelné rizikové faktory pro budoucí výzkum. Ve WP3.3 budou studovány buněčné signální dráhy zánětu v podskupině naší kohorty. Konkrétně bude hodnocena interakce aktivace NFκΒ a citlivosti glukokortikoidního receptoru v mononukleárních buňkách pacientů a korelována s reaktivací CMV a výsledkem.

WP4 zahrnuje prospektivní detekci a kvantifikaci CMV-DNA v různých biologických vzorcích. Všechna data budou zahrnuta do hlavní databáze a hlavně bude vytvořena DNA banka pro případnou budoucí detekci dalších herpesvirů.

WP5 vyhodnotí specifické imunitní reakce na CMV u podskupiny pacientů. Ty budou korelovat se základním onemocněním, reaktivací a stresem. Kromě toho bude v budoucnu vytvořena banka supernatantů z těchto experimentů pro měření cytokinů (Luminex).