Reactivación de la infección por CMV en pacientes inmunocompetentes bajo estrés severo (RECYSTRESS)

Se trata de un estudio observacional prospectivo multicéntrico de pacientes CMV seropositivos (niños y adultos) ingresados ​​en UCI. Se reclutarán dos unidades de UCI pediátricas y cuatro de adultos en hospitales docentes terciarios durante 48 y 36 meses respectivamente.

Plan de investigación Al momento de la admisión en la UCI, los pacientes (grupo A y B) serán seleccionados para los criterios de inclusión/exclusión y después de obtener el consentimiento informado por escrito, se inscribirá al paciente. La gravedad clínica se estimará utilizando sistemas de puntuación estandarizados (PRISM III y APACHI II respectivamente). Todos los antecedentes demográficos, médicos, presentaciones clínicas e intervenciones médicas pertinentes se ingresarán en una base de datos. Previo a iniciar cualquier tratamiento de soporte (inotrópicos o corticoides) se tomará sangre y saliva para la determinación de marcadores biológicos de estrés. Se recolectará suero y sangre completa para la determinación de anticuerpos CMV-IgG y CMV-DNA respectivamente. Los pacientes CMV seronegativos serán excluidos de una evaluación adicional. Los pacientes seropositivos serán seguidos prospectivamente durante 28 días. El seguimiento semanal (7, 14, 21 y 28 días de hospitalización) incluirá: evaluación clínica y de laboratorio, documentación de la intervención terapéutica y evaluación de la reactivación del CMV (detección de ADN-CMV). Los marcadores de estrés se volverán a examinar solo el día 7. El día 28 (final del seguimiento) se registrará el resultado clínico.

En un subconjunto aleatorio de pacientes (20 niños y 20 adultos) se estudiará la vía de señalización intracelular de la inflamación y las respuestas inmunitarias específicas.

Métodos de laboratorio

A) Serología para CMV: Los anticuerpos CMV-IgG en suero se medirán mediante el método de inmunoensayo enzimático (Elisa, Abbott Laboratories) en el laboratorio de serología del hospital.

B) Estimación de indicadores biológicos de estrés

B.1. Medición de cortisol libre. Se recolectarán muestras de saliva tres veces al día (8.00 am, 2.00 pm y 8.00 pm) para determinar el patrón circadiano de secreción de cortisol utilizando hisopos sintéticos especiales (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) y almacenados a -70oC. Los niveles de cortisol se determinarán con inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (kit de reactivos Elecsys Cortisol, ROCHE).

B.2. Catecolaminas plasmáticas. Los niveles de catecolaminas (noradrenalina, adrenalina y dopamina) se medirán antes del inicio de la terapia con cualquier agente inotrópico. Las muestras se tomarán de un catéter venoso con el paciente en decúbito supino sólo en pacientes que no reciban inotrópicos. El plasma se almacenará a -85oC. Se utilizará la fase inversa de HPLC líquida (cromatografía líquida de alta resolución - fase inversa).

B.3. El TNF-a sérico se medirá mediante el método de inmunoensayo enzimático tipo sándwich cuantitativo (Elecsys, ROCHE).

C) Detección y cuantificación de CMV-DNA a partir de sangre total y lavado broncoalveolar (BAL, en pacientes ventilados). Si se da de alta a un paciente antes del día 28, se administrarán salivettes en casa para recolectar saliva para la determinación de ADN-CMV (almacenadas en el refrigerador de la casa) y se devolverán el día 28. Las muestras se almacenarán a -70oC y todas las muestras de cada paciente se examinarán al mismo tiempo. La extracción de ADN y la PCR en tiempo real se realizarán mediante kits comerciales (Nanogen Advanced Diagnostics). Se detectará una región del gen que codifica el antígeno temprano inmediato principal (MIEA) del CMV. Todas las pruebas de PCR se realizarán en el Laboratorio de Citología, Hospital Universitario Attikon, Atenas, Grecia (Profesor asociado P. Karakitsos).

D) Las mediciones del receptor de glucocorticoides (GR) y del factor nuclear κB (NFκB) en células completas y extractos nucleares de linfocitos de sangre periférica se realizarán mediante inmunotransferencia en el Departamento de Química Biológica de la Universidad de Atenas (Ass. Profesor P. Moutsatsou)8

E) Respuesta inmune específica contra CMV. Las respuestas inmunitarias específicas de los linfocitos T CD4+ y CD8+ de sangre periférica después de la estimulación in vitro con polipéptidos de CMV (incluido el antígeno pp65) se estudiarán con tinción intracelular (tinción intracelular, ICS). Se evaluará la proliferación de CD4+ (CFSE) y la citotoxicidad de CD8+ (perforina y granzima B).

Análisis estadístico Para el análisis de datos se examinarán por separado adultos y niños. Los pacientes seropositivos sin reactivación de CMV se utilizarán como grupo de control. Un valor de p (p) de ≤0,05 es el criterio de significación estadística. La prueba T y la prueba de chi-cuadrado se utilizarán para el análisis cuantitativo y cualitativo, mientras que el método de Mantel-Haenzel se utilizará para calcular el riesgo relativo de diferentes resultados (mortalidad, intubación, etc.) entre los dos grupos. Para identificar los factores de riesgo potenciales asociados con la reactivación del CMV y el resultado clínico, se realizará un análisis de regresión logística utilizando el programa estadístico SAS v.9.

Cálculo de la muestra Para calcular el tamaño de la muestra del estudio se utilizó el programa estadístico EpiInfo versión 6. Según datos recientes de adultos, el 30 % puede demostrar una reactivación del CMV mientras está en la UCI. Se ha estimado que la tasa de mortalidad en la UCI pediátrica y de adultos alcanza aproximadamente el 8% y el 63% respectivamente. Datos recientes sugieren que la reactivación del CMV se asocia con mayor mortalidad (RR=1,93) y morbilidad (RR=5,70). El tamaño de la muestra se calculó para cumplir con los criterios de intervalo de confianza del 99% y poder estadístico del 90%. Estimamos que nuestra población CMV (+) debería incluir 165 niños y 109 adultos.

Los paquetes de trabajo WP1 y WP2 involucran investigación clínica; inscripción y seguimiento clínico de niños y adultos respectivamente. Toda la recopilación de datos se ingresará en una base de datos anónima que incluirá datos demográficos, antecedentes, evaluación clínica y de laboratorio, manejo clínico e intervenciones al ingreso y durante el período de seguimiento. Adultos y niños serán evaluados por separado. Una vez que se proporcionan los resultados de CMV (WP4), los factores de riesgo asociados con la reactivación de CMV, así como los resultados clínicos adversos, incluidos los directamente (es decir, neumonitis, episodios febriles y hepatitis) e indirectamente asociados (es decir, se examinará la estancia prolongada en la UCI o la ventilación mecánica y el aumento de la tasa de infecciones bacterianas).

WP3 implica la evaluación del estrés desde una investigación clínica (WP3.1 y WP 3.2) y básica (WP3.3) acercarse. Los marcadores bioquímicos de estrés se evaluarán al ingreso y el día 7 para examinar la duración del estrés. Se tendrá en cuenta la administración concomitante de fármacos. Los marcadores de estrés se correlacionarán con la reactivación del CMV y el resultado clínico para examinar si pueden usarse como factores de riesgo identificables para investigaciones futuras. En WP3.3, se estudiarán las vías de señalización celular de la inflamación en un subconjunto de nuestra cohorte. Específicamente, la interacción de la activación de NFκΒ y la sensibilidad del receptor de glucocorticoides en las células mononucleares de los pacientes se evaluará y se correlacionará con la reactivación y el resultado del CMV.

WP4 implica la detección prospectiva y la cuantificación de CMV-DNA en diferentes muestras biológicas. Todos los datos se incluirán en la base de datos principal y, lo que es más importante, se formará un banco de ADN para la posible detección de otros herpesvirus en el futuro.

WP5 evaluará las respuestas inmunitarias específicas al CMV en un subconjunto de pacientes. Estos se correlacionarán con la enfermedad de base, la reactivación y el estrés. Además, se formará un banco de sobrenadantes de esos experimentos para medir citocinas (Luminex) en el futuro.