Reaktivering af CMV-infektion hos immunkompetente patienter under svær stress (RECYSTRESS)

Dette er en multicenter prospektiv observationsundersøgelse af CMV seropositive patienter (børn og voksne) indlagt på intensivafdeling. To pædiatriske og fire voksne intensivafdelinger på tertiære undervisningshospitaler vil rekruttere i henholdsvis 48 og 36 måneder.

Forskningsplan Ved indlæggelse på intensivafdeling vil patienter (gruppe A og B) blive screenet for inklusions-/udelukkelseskriterier, og efter skriftligt informeret samtykke vil patienten blive indskrevet. Klinisk sværhedsgrad vil blive estimeret ved hjælp af standardiserede scoresystemer (henholdsvis PRISM III og APACHI II). Alle relevante demografiske, sygehistorier, kliniske præsentationer og medicinske indgreb vil blive indtastet i en database. Forud for påbegyndelse af enhver understøttende behandling (inotroper eller kortikosteroider) vil der blive udtaget blod og spyt til bestemmelse af biologiske markører for stress. Serum og fuldblod vil blive opsamlet til bestemmelse af henholdsvis CMV-IgG-antistoffer og CMV-DNA. CMV seronegative patienter vil blive udelukket fra yderligere evaluering. Seropositive patienter vil blive fulgt prospektivt i 28 dage. Ugentlig opfølgning (7., 14., 21. og 28. dag for hospitalsindlæggelse) vil omfatte: klinisk og laboratorieevaluering, dokumentation af terapeutisk intervention og CMV-reaktiveringsvurdering (CMV-DNA-detektion). Stressmarkører vil først blive undersøgt igen på dag 7. På dag 28 (slut med opfølgning) vil det kliniske resultat blive registreret.

I en tilfældig undergruppe af patienter (20 børn og 20 voksne) vil den intracellulære signalvej for inflammation og specifikke immunresponser blive undersøgt.

Laboratoriemetoder

A) Serologi for CMV: Serum CMV-IgG-antistoffer vil blive målt ved hjælp af enzymimmunoassay-metoden (Elisa, Abbott Laboratories) i hospitalets serologiske laboratorium.

B) Estimering af biologiske stressindikatorer

B.1. Måling af fri kortisol. Spytprøver vil blive indsamlet tre gange om dagen (8.00, 14.00 og 20.00) for at bestemme den cirkadiske kortisolsekretion ved hjælp af specielle syntetiske podninger (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) og opbevaret ved -70oC. Kortisolniveauer vil blive bestemt med elektrokemiluminescens immunoassay (Elecsys Cortisol reagenskit, ROCHE).

B.2. Plasma katekolaminer. Katekolaminniveauer (noradrenalin, adrenalin og dopamin) vil blive målt før påbegyndelse af behandlingen med ethvert inotropt middel. Prøver vil kun blive taget fra et venekateter med patienten på ryggen hos patienter, der ikke får inotrope. Plasma vil blive opbevaret ved -85oC. Flydende HPLC omvendt fase (High Performance Liquid Chromatography - omvendt fase) vil blive brugt.

B.3. Serum TNF-a vil blive målt ved kvantitativ sandwich-enzymimmunoassay-metode (Elecsys, ROCHE).

C) Påvisning og kvantificering af CMV-DNA fra fuldblod og bronkoalveolær lavage (BAL, hos ventilerede patienter). Hvis en patient udskrives før dag 28, vil salivetter blive givet hjemme for at opsamle spyt til CMV-DNA-bestemmelse (opbevares i hjemmekøleskab) og returneres på dag 28. Prøver vil blive opbevaret ved -70oC, og alle prøver fra hver patient vil blive undersøgt på samme tid. DNA-ekstraktion og real-time PCR vil blive udført af kommercielle kits (Nanogen Advanced Diagnostics). En genregion, der koder for Major Immediate Early Antigen (MIEA) af CMV vil blive påvist. Al PCR-test vil blive udført på Cytologilaboratoriet, Attikon Universitetshospital, Athen, Grækenland (lektor P. Karakitsos).

D) Målinger af glukokortikoidreceptor (GR) og nuklear faktor κB (NFκB) i helcelle- og nukleare ekstrakter fra perifere blodlymfocytter vil blive udført ved immunblotting ved Institut for Biologisk Kemi, Athens Universitet (ass. Prof P. Moutsatsou)8

E) Specifik immunrespons mod CMV. Specifikke immunresponser af CD4+ og CD8+ T-lymfocytter fra perifert blod efter in vitro-stimulering med CMV-polypeptider (inklusive pp65-antigen) vil blive undersøgt med intracellulær farvning (Intracellulær farvning, ICS). Proliferationen af ​​CD4+ (CFSE) og cytotoksiciteten af ​​CD8+ (perforin og granzym B) vil blive vurderet.

Statistisk analyse Til dataanalysen vil voksne og børn blive undersøgt separat. Seropositive patienter uden CMV-reaktivering vil blive brugt som kontrolgruppe. En p-værdi (p) på ≤0,05 er kriteriet for statistisk signifikans. T-test og chi-square test vil blive brugt til kvantitativ og kvalitativ analyse, mens Mantel-Haenzel metoden vil blive brugt til at beregne relativ risiko for forskellige udfald (dødelighed, intubation osv.) mellem de to grupper. For at identificere potentielle risikofaktorer forbundet med CMV-reaktivering og klinisk resultat, vil der blive udført logistisk regressionsanalyse ved hjælp af det statistiske program SAS v.9.

Prøveberegning For at beregne undersøgelsens stikprøvestørrelse blev det statistiske program EpiInfo version 6 brugt. Baseret på nylige data fra voksne kan 30 % påvise CMV-reaktivering, mens de er på intensivafdelingen. Dødeligheden på intensivafdelingen for børn og voksne er blevet estimeret til at nå op på henholdsvis ca. 8 % og 63 %. Nylige data tyder på, at CMV-reaktivering er forbundet med øget dødelighed (RR=1,93) og morbiditet (RR=5,70). Stikprøvestørrelsen blev beregnet til at opfylde kriterierne om 99 % konfidensinterval og 90 % statistisk styrke. Vi estimerede, at vores CMV(+)-population skulle omfatte 165 børn og 109 voksne.

Arbejdspakker WP1 og WP2 involverer klinisk forskning; indskrivning og klinisk opfølgning af henholdsvis børn og voksne. Al dataindsamling vil blive indtastet i en anonym database, som vil omfatte demografiske data, tidligere historie, klinisk og laboratorieevaluering, klinisk ledelse og interventioner ved indlæggelse og i opfølgningsperioden. Voksne og børn vil blive evalueret separat. Når først CMV-resultater er tilvejebragt (WP4), kan risikofaktorer forbundet med CMV-reaktivering såvel som ugunstige kliniske resultater, herunder både de direkte (dvs. pneumonitis, feberepisoder og hepatitis) og indirekte associeret (dvs. forlænget intensivophold eller mekanisk ventilation og øget frekvens af bakterielle infektioner) vil blive undersøgt.

WP3 involverer evaluering af stress fra en klinisk (WP3.1 og WP 3.2) og grundforskning (WP3.3) nærme sig. Biokemiske stressmarkører vil blive evalueret ved indlæggelse og på dag 7 for at undersøge varigheden af ​​stress. Samtidig medicinindgivelse vil blive taget i betragtning. Stressmarkører vil blive korreleret med CMV-reaktivering og kliniske resultater for at undersøge, om de kan bruges som identificerbare risikofaktorer for fremtidig forskning. I WP3.3 vil cellulære signalveje for inflammation i en undergruppe af vores kohorte blive undersøgt. Specifikt vil interaktionen af ​​NFκΒ-aktivering og glukokortikoidreceptorfølsomhed i patienters mononukleære celler blive evalueret og korreleret med CMV-reaktivering og -resultat.

WP4 involverer prospektiv påvisning og kvantificering af CMV-DNA i forskellige biologiske prøver. Alle data vil blive inkluderet i hoveddatabasen, og endnu vigtigere vil der blive dannet en DNA-bank til mulig påvisning af andre herpesvira i fremtiden.

WP5 vil evaluere specifikke immunresponser på CMV i en undergruppe af patienter. Disse vil være korreleret med den underliggende sygdom, reaktivering og stress. Desuden vil en bank af supernatanter fra disse eksperimenter blive dannet for at måle cytokiner (Luminex) i fremtiden.