Reaktivering av CMV-infeksjon hos immunkompetente pasienter under alvorlig stress (RECYSTRESS)

Dette er en multisenter prospektiv observasjonsstudie av CMV-seropositive pasienter (barn og voksne) innlagt på intensivavdeling. To pediatriske og fire ICU-enheter for voksne i tertiære undervisningssykehus vil rekruttere i henholdsvis 48 og 36 måneder.

Forskningsplan Ved innleggelse på intensivavdelingen vil pasienter (gruppe A og B) screenes for inklusjons-/eksklusjonskriterier og etter at skriftlig informert samtykke er innhentet vil pasienten bli innrullert. Klinisk alvorlighetsgrad vil bli estimert ved bruk av standardiserte skårsystemer (henholdsvis PRISM III og APACHI II). All relevant demografi, medisinsk historie, klinisk presentasjon og medisinske intervensjoner vil bli lagt inn i en database. Før oppstart av støttebehandling (inotroper eller kortikosteroider) vil blod og spytt bli innhentet for å bestemme biologiske markører for stress. Serum og fullblod vil bli samlet inn for bestemmelse av henholdsvis CMV-IgG-antistoffer og CMV-DNA. CMV seronegative pasienter vil bli ekskludert fra videre evaluering. Seropositive pasienter vil bli fulgt prospektivt i 28 dager. Ukentlig oppfølging (7., 14., 21. og 28. dag sykehusinnleggelse) vil omfatte: klinisk og laboratorieevaluering, dokumentasjon av terapeutisk intervensjon og CMV-reaktiveringsvurdering (CMV-DNA-deteksjon). Stressmarkører vil kun undersøkes på nytt på dag 7. På dag 28 (slutten av oppfølgingen) vil det kliniske resultatet bli registrert.

I en tilfeldig undergruppe av pasienter (20 barn og 20 voksne) vil den intracellulære signalveien for betennelse og spesifikke immunresponser bli studert.

Laboratoriemetoder

A) Serologi for CMV: Serum CMV-IgG-antistoffer vil bli målt ved hjelp av Enzyme Immunoassay Method (Elisa, Abbott Laboratories) i sykehusets serologiske laboratorium.

B) Estimering av biologiske stressindikatorer

B.1. Måling av fritt kortisol. Spyttprøver vil bli tatt tre ganger om dagen (08.00, 14.00 og 20.00) for å bestemme døgnmønsteret kortisolsekresjon ved bruk av spesielle syntetiske vattpinner (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) og lagret ved -70oC. Kortisolnivåer vil bli bestemt med elektrokjemiluminescens immunoassay (Elecsys Cortisol reagent kit, ROCHE).

B.2. Plasma katekolaminer. Katekolaminnivåer (noradrenalin, adrenalin og dopamin) vil bli målt før oppstart av behandling med ethvert inotropt middel. Prøver tas fra et venekateter med pasienten liggende kun hos pasienter som ikke får inotrope. Plasma vil bli lagret ved -85oC. Flytende HPLC revers fase (High Performance Liquid Chromatography - revers fase) vil bli brukt.

B.3. Serum TNF-a vil bli målt ved kvantitativ sandwich-enzymimmunoassay-metode (Elecsys, ROCHE).

C) Påvisning og kvantifisering av CMV-DNA fra fullblod og bronkoalveolær lavage (BAL, hos ventilerte pasienter). Hvis en pasient skrives ut før dag 28, vil salivetter bli gitt hjemme for å samle spytt for CMV-DNA-bestemmelse (oppbevares i hjemmekjøleskapet) og returneres på dag 28. Prøver vil bli lagret ved -70oC og alle prøver fra hver pasient vil bli undersøkt samtidig. DNA-ekstraksjon og sanntids-PCR vil bli utført av kommersielle sett (Nanogen Advanced Diagnostics). En genregion som koder for Major Immediate Early Antigen (MIEA) til CMV vil bli oppdaget. All PCR-testing vil bli utført ved cytologilaboratoriet, Attikon universitetssykehus, Athen, Hellas (lektor P. Karakitsos).

D) Målinger av glukokortikoidreseptor (GR) og nukleær faktor κB (NFκB) i helcelle- og kjerneekstrakter fra perifere blodlymfocytter vil bli utført ved immunblotting ved Institutt for biologisk kjemi, Athens universitet (ass. Prof P. Moutsatsou)8

E) Spesifikk immunrespons mot CMV. Spesifikke immunresponser av CD4+ og CD8+ T-lymfocytter fra perifert blod etter in vitro stimulering med CMV polypeptider (inkludert pp65 antigen) vil bli studert med intracellulær farging (Intracellulær farging, ICS). Proliferasjonen av CD4+ (CFSE) og cytotoksisiteten til CD8+ (perforin og granzym B) vil bli vurdert.

Statistisk analyse For dataanalysen vil voksne og barn bli undersøkt separat. Seropositive pasienter uten CMV-reaktivering vil bli brukt som kontrollgruppe. En p-verdi (p) på ≤0,05 er kriteriet for statistisk signifikans. T-test og kjikvadrattest vil bli brukt for kvantitativ og kvalitativ analyse, mens Mantel-Haenzel metoden vil bli brukt for å beregne relativ risiko for ulike utfall (dødelighet, intubasjon, etc) mellom de to gruppene. For å identifisere potensielle risikofaktorer knyttet til CMV-reaktivering og klinisk utfall, vil det bli utført logistisk regresjonsanalyse ved bruk av statistikkprogrammet SAS v.9.

Prøveberegning For å beregne utvalgets størrelse ble statistikkprogrammet EpiInfo versjon 6 brukt. Basert på nyere data fra voksne, kan 30 % demonstrere CMV-reaktivering mens de er på intensivavdelingen. Dødeligheten på intensivavdelingen for barn og voksne er estimert til å nå henholdsvis omtrent 8 % og 63 %. Nyere data tyder på at CMV-reaktivering er assosiert med økt dødelighet (RR=1,93) og morbiditet (RR=5,70). Utvalgsstørrelsen ble beregnet for å oppfylle kriteriene på 99 % konfidensintervall og 90 % statistisk styrke. Vi estimerte at vår CMV(+)-populasjon skulle omfatte 165 barn og 109 voksne.

Arbeidspakkene WP1 og WP2 involverer klinisk forskning; påmelding og klinisk oppfølging av henholdsvis barn og voksne. All datainnsamling vil bli lagt inn i en anonym database som vil inkludere demografiske data, tidligere historie, klinisk og laboratorieevaluering, klinisk ledelse og intervensjoner ved innleggelse og i oppfølgingsperioden. Voksne og barn vil bli vurdert separat. Når CMV-resultater er gitt (WP4), risikofaktorer assosiert med CMV-reaktivering så vel som uønskede kliniske utfall, inkludert begge direkte (dvs. pneumonitt, feberepisoder og hepatitt) og indirekte assosiert (dvs. utvidet intensivopphold eller mekanisk ventilasjon, og økt forekomst av bakterielle infeksjoner) vil bli undersøkt.

WP3 innebærer evaluering av stress fra en klinisk (WP3.1 og WP 3.2) og grunnleggende forskning (WP3.3) nærme seg. Biokjemiske stressmarkører vil bli evaluert ved innleggelse og på dag 7 for å undersøke varigheten av stress. Samtidig legemiddeladministrasjon vil bli tatt i betraktning. Stressmarkører vil bli korrelert med CMV-reaktivering og klinisk utfall for å undersøke om de kan brukes som identifiserbare risikofaktorer for fremtidig forskning. I WP3.3 vil cellulære signalveier for betennelse i en undergruppe av vår kohort bli studert. Spesielt vil interaksjonen mellom NFκΒ-aktivering og glukokortikoidreseptorfølsomhet i pasientenes mononukleære celler bli evaluert og korrelert med CMV-reaktivering og utfall.

WP4 involverer prospektiv påvisning og kvantifisering av CMV-DNA i forskjellige biologiske prøver. Alle data vil bli inkludert i hoveddatabasen og enda viktigere vil det bli dannet en DNA-bank for mulig påvisning av andre herpesvirus i fremtiden.

WP5 vil evaluere spesifikke immunresponser mot CMV hos en undergruppe av pasienter. Disse vil være korrelert med den underliggende sykdommen, reaktivering og stress. Dessuten vil en bank av supernatanter fra disse eksperimentene bli dannet for å måle cytokiner (Luminex) i fremtiden.