Reaktivierung einer CMV-Infektion bei immunkompetenten Patienten unter starkem Stress (RECYSTRESS)

Dies ist eine multizentrische prospektive Beobachtungsstudie an CMV-seropositiven Patienten (Kinder und Erwachsene), die auf der Intensivstation aufgenommen wurden. Zwei pädiatrische und vier Intensivstationen für Erwachsene in tertiären Lehrkrankenhäusern werden für 48 bzw. 36 Monate rekrutieren.

Forschungsplan Bei der Aufnahme auf die Intensivstation werden die Patienten (Gruppe A und B) auf Einschluss-/Ausschlusskriterien untersucht und nach Einholung einer schriftlichen Einverständniserklärung wird der Patient aufgenommen. Der klinische Schweregrad wird anhand standardisierter Score-Systeme (PRISM III bzw. APACHI II) abgeschätzt. Alle relevanten demografischen Daten, Krankengeschichten, klinischen Präsentationen und medizinischen Eingriffe werden in eine Datenbank eingegeben. Vor Beginn einer unterstützenden Behandlung (Inotropika oder Kortikosteroide) werden Blut und Speichel zur Bestimmung biologischer Stressmarker entnommen. Serum und Vollblut werden zur Bestimmung von CMV-IgG-Antikörpern bzw. CMV-DNA entnommen. CMV-seronegative Patienten werden von der weiteren Bewertung ausgeschlossen. Seropositive Patienten werden 28 Tage lang prospektiv nachbeobachtet. Die wöchentliche Nachsorge (7., 14., 21. und 28. Tag des Krankenhausaufenthalts) umfasst: klinische und Laboruntersuchung, Dokumentation der therapeutischen Intervention und Bewertung der CMV-Reaktivierung (CMV-DNA-Nachweis). Stressmarker werden erst am 7. Tag erneut untersucht. Am 28. Tag (Ende der Nachsorge) wird das klinische Ergebnis aufgezeichnet.

An einer zufälligen Untergruppe von Patienten (20 Kinder und 20 Erwachsene) werden der intrazelluläre Signalweg von Entzündungen und spezifische Immunantworten untersucht.

Labormethoden

A) Serologie für CMV: Serum-CMV-IgG-Antikörper werden mit der Enzymimmunoassay-Methode (Elisa, Abbott Laboratories) im Serologielabor des Krankenhauses gemessen.

B) Abschätzung biologischer Stressindikatoren

B.1. Messung von freiem Cortisol. Speichelproben werden dreimal täglich (8.00 Uhr, 14.00 Uhr und 20.00 Uhr) gesammelt, um das zirkadiane Muster der Cortisolsekretion mit speziellen synthetischen Tupfern (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) zu bestimmen, und bei -70 °C gelagert. Die Cortisolspiegel werden mit einem Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (Elecsys Cortisol-Reagenzienkit, ROCHE) bestimmt.

B.2. Plasma-Katecholamine. Die Katecholaminspiegel (Noradrenalin, Adrenalin und Dopamin) werden vor Beginn der Therapie mit einem inotropen Mittel gemessen. Nur bei Patienten, die keine Inotropika erhalten, werden Proben aus einem Venenkatheter in Rückenlage des Patienten entnommen. Plasma wird bei -85 °C gelagert. Es wird die Flüssig-HPLC-Umkehrphase (High Performance Liquid Chromatography - Umkehrphase) verwendet.

B.3. Serum-TNF-a wird durch ein quantitatives Sandwich-Enzym-Immunoassay-Verfahren (Elecsys, ROCHE) gemessen.

C) Nachweis und Quantifizierung von CMV-DNA aus Vollblut und bronchoalveolärer Lavage (BAL, bei beatmeten Patienten). Wenn ein Patient vor dem 28. Tag entlassen wird, werden Salivetten nach Hause gegeben, um Speichel für die CMV-DNA-Bestimmung zu sammeln (im Kühlschrank zu Hause aufbewahrt) und am 28. Tag zurückgegeben. Die Proben werden bei -70 °C gelagert und alle Proben von jedem Patienten werden gleichzeitig untersucht. DNA-Extraktion und Echtzeit-PCR werden mit kommerziellen Kits (Nanogen Advanced Diagnostics) durchgeführt. Eine Genregion, die das Major Immediate Early Antigen (MIEA) von CMV codiert, wird nachgewiesen. Alle PCR-Tests werden im Cytology Laboratory, Attikon University Hospital, Athen, Griechenland (Associate Prof. P. Karakitsos) durchgeführt.

D) Messungen des Glukokortikoidrezeptors (GR) und des Nuklearfaktors κB (NFκB) in Ganzzell- und Kernextrakten aus peripheren Blutlymphozyten werden durch Immunoblotting am Institut für Biologische Chemie der Universität Athen (Ass. Prof. P. Moutsatsou)8

E) Spezifische Immunantwort gegen CMV. Spezifische Immunantworten von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten aus peripherem Blut nach In-vitro-Stimulation mit CMV-Polypeptiden (einschließlich pp65-Antigen) werden mit intrazellulärer Färbung (Intrazelluläre Färbung, ICS) untersucht. Die Proliferation von CD4+ (CFSE) und die Zytotoxizität von CD8+ (Perforin und Granzyme B) werden bewertet.

Statistische Analyse Für die Datenanalyse werden Erwachsene und Kinder getrennt untersucht. Als Kontrollgruppe werden seropositive Patienten ohne CMV-Reaktivierung verwendet. Ein p-Wert (p) von ≤ 0,05 ist das Kriterium für statistische Signifikanz. Der T-Test und der Chi-Quadrat-Test werden für die quantitative und qualitative Analyse verwendet, während die Mantel-Haenzel-Methode verwendet wird, um das relative Risiko unterschiedlicher Ergebnisse (Mortalität, Intubation usw.) zwischen den beiden Gruppen zu berechnen. Um potenzielle Risikofaktoren im Zusammenhang mit einer CMV-Reaktivierung und dem klinischen Ergebnis zu identifizieren, wird eine logistische Regressionsanalyse mit dem Statistikprogramm SAS v.9 durchgeführt.

Stichprobenberechnung Zur Berechnung der Stichprobengröße der Studie wurde das Statistikprogramm EpiInfo Version 6 verwendet. Basierend auf aktuellen Daten von Erwachsenen können 30 % auf der Intensivstation eine CMV-Reaktivierung zeigen. Die Sterblichkeitsrate auf der Intensivstation für Kinder und Erwachsene wird auf etwa 8 % bzw. 63 % geschätzt. Neuere Daten deuten darauf hin, dass die CMV-Reaktivierung mit erhöhter Mortalität (RR=1,93) und Morbidität (RR=5,70) verbunden ist. Die Stichprobengröße wurde so berechnet, dass sie die Kriterien von 99 % Konfidenzintervall und 90 % statistischer Aussagekraft erfüllt. Wir schätzten, dass unsere CMV(+)-Population 165 Kinder und 109 Erwachsene umfassen sollte.

Die Arbeitspakete AP1 und AP2 beinhalten klinische Forschung; Einschreibung und klinische Nachsorge von Kindern bzw. Erwachsenen. Die gesamte Datensammlung wird in eine anonyme Datenbank eingegeben, die demografische Daten, Vorgeschichte, klinische und Laborbewertung, klinisches Management und Interventionen bei der Aufnahme und während der Nachsorgezeit enthält. Erwachsene und Kinder werden getrennt gewertet. Sobald die CMV-Ergebnisse vorliegen (AP4), werden Risikofaktoren im Zusammenhang mit einer CMV-Reaktivierung sowie nachteilige klinische Ergebnisse, einschließlich sowohl direkter (d. h. Pneumonitis, Fieberschübe und Hepatitis) und indirekt assoziiert (d. h. verlängerter Aufenthalt auf der Intensivstation oder mechanische Beatmung und erhöhte Rate bakterieller Infektionen) untersucht werden.

AP3 beinhaltet die Bewertung von Stress aus klinischer (AP3.1 und AP 3.2) und Grundlagenforschung (AP3.3) Ansatz. Biochemische Stressmarker werden bei der Aufnahme und am 7. Tag ausgewertet, um die Dauer des Stresses zu untersuchen. Die gleichzeitige Verabreichung von Arzneimitteln wird berücksichtigt. Stressmarker werden mit der CMV-Reaktivierung und dem klinischen Ergebnis korreliert, um zu untersuchen, ob sie als identifizierbare Risikofaktoren für die zukünftige Forschung verwendet werden können. In WP3.3 werden zelluläre Signalwege von Entzündungen in einer Untergruppe unserer Kohorte untersucht. Insbesondere wird die Interaktion der NFκΒ-Aktivierung und der Glukokortikoidrezeptor-Empfindlichkeit in den mononukleären Zellen der Patienten bewertet und mit der CMV-Reaktivierung und dem Ergebnis korreliert.

WP4 beinhaltet den prospektiven Nachweis und die Quantifizierung von CMV-DNA in verschiedenen biologischen Proben. Alle Daten werden in die Hauptdatenbank aufgenommen, und was noch wichtiger ist, es wird eine DNA-Bank für den möglichen Nachweis anderer Herpesviren in der Zukunft gebildet.

WP5 wird spezifische Immunantworten auf CMV bei einer Untergruppe von Patienten bewerten. Diese werden mit der Grunderkrankung, Reaktivierung und Stress korreliert. Darüber hinaus wird eine Bank von Überständen aus diesen Experimenten gebildet, um in Zukunft Zytokine (Luminex) zu messen.