Riattivazione dell'infezione da CMV in pazienti immunocompetenti sottoposti a grave stress (RECYSTRESS)

Si tratta di uno studio osservazionale prospettico multicentrico su pazienti sieropositivi per CMV (bambini e adulti) ricoverati in terapia intensiva. Due unità di terapia intensiva pediatrica e quattro per adulti negli ospedali universitari universitari saranno reclutate rispettivamente per 48 e 36 mesi.

Piano di ricerca Al momento del ricovero in terapia intensiva, i pazienti (gruppo A e B) saranno sottoposti a screening per criteri di inclusione / esclusione e dopo aver ottenuto il consenso informato scritto il paziente verrà arruolato. La gravità clinica sarà stimata utilizzando sistemi di punteggio standardizzati (rispettivamente PRISM III e APACHI II). Tutti i dati demografici, la storia medica, la presentazione clinica e gli interventi medici pertinenti verranno inseriti in un database. Prima di iniziare qualsiasi trattamento di supporto (inotropi o corticosteroidi) verranno prelevati sangue e saliva per la determinazione dei marcatori biologici dello stress. Verranno prelevati siero e sangue intero per la determinazione rispettivamente degli anticorpi CMV-IgG e CMV-DNA. I pazienti sieronegativi per CMV saranno esclusi da ulteriori valutazioni. I pazienti sieropositivi saranno seguiti prospetticamente per 28 giorni. Il follow-up settimanale (7°, 14°, 21° e 28° giorno di ricovero) comprenderà: valutazione clinica e di laboratorio, documentazione dell'intervento terapeutico e valutazione della riattivazione del CMV (rilevamento del CMV-DNA). I marcatori di stress saranno riesaminati solo il giorno 7. Il giorno 28 (fine del follow-up) verrà registrato l'esito clinico.

In un sottogruppo casuale di pazienti (20 bambini e 20 adulti) verrà studiata la via di segnalazione intracellulare dell'infiammazione e specifiche risposte immunitarie.

Metodi di laboratorio

A) Sierologia per CMV: Gli anticorpi sierici CMV-IgG saranno misurati mediante metodo immunoenzimatico (Elisa, Abbott Laboratories) nel laboratorio di sierologia dell'ospedale.

B) Stima degli indicatori di stress biologico

B.1. Misurazione del cortisolo libero. I campioni di saliva saranno raccolti tre volte al giorno (8:00, 14:00 e 20:00) per determinare il modello circadiano della secrezione di cortisolo utilizzando tamponi sintetici speciali (Salivetta-Salivette, Sarsted ®) e conservati a -70oC. I livelli di cortisolo saranno determinati mediante saggio immunologico di elettrochemiluminescenza (Elecsys Cortisol reagent kit, ROCHE).

B.2. Catecolamine plasmatiche. I livelli di catecolamine (noradrenalina, adrenalina e dopamina) saranno misurati prima dell'inizio della terapia con qualsiasi agente inotropo. I campioni verranno prelevati da un catetere venoso con il paziente supino solo nei pazienti che non ricevono inotropi. Il plasma sarà conservato a -85oC. Verrà utilizzata la fase inversa HPLC liquida (cromatografia liquida ad alta prestazione - fase inversa).

B.3. Il TNF-a sierico sarà misurato mediante metodo immunoenzimatico quantitativo-sandwich (Elecsys, ROCHE).

C) Rilevazione e quantificazione del DNA di CMV da sangue intero e lavaggio broncoalveolare (BAL, in pazienti ventilati). Se un paziente viene dimesso prima del giorno 28, le salivette verranno somministrate a casa per raccogliere la saliva per la determinazione del CMV-DNA (conservate nel frigorifero di casa) e restituite il giorno 28. I campioni saranno conservati a -70oC e tutti i campioni di ciascun paziente saranno esaminati contemporaneamente. L'estrazione del DNA e la PCR in tempo reale saranno eseguite mediante kit commerciali (Nanogen Advanced Diagnostics). Verrà rilevata una regione genica che codifica per il Major Immediate Early Antigen (MIEA) di CMV. Tutti i test PCR saranno eseguiti presso il Laboratorio di Citologia, Ospedale Universitario Attikon, Atene, Grecia (Prof. Associato P. Karakitsos).

D) Le misurazioni del recettore dei glucocorticoidi (GR) e del fattore nucleare κB (NFκB) in cellule intere e estratti nucleari di linfociti del sangue periferico saranno eseguite mediante immunoblotting presso il Dipartimento di Chimica Biologica, Università di Atene (Ass. Prof P. Moutsatsou)8

E) Risposta immunitaria specifica contro CMV. Le risposte immunitarie specifiche dei linfociti T CD4+ e CD8+ da sangue periferico dopo stimolazione in vitro con polipeptidi CMV (compreso l'antigene pp65) saranno studiate con colorazione intracellulare (colorazione intracellulare, ICS). Verrà valutata la proliferazione di CD4+ (CFSE) e la citotossicità di CD8+ (perforina e granzima B).

Analisi statistica Per l'analisi dei dati adulti e bambini saranno esaminati separatamente. I pazienti sieropositivi senza riattivazione di CMV saranno utilizzati come gruppo di controllo. Un valore p (p) di ≤0,05 è il criterio per la significatività statistica. Il test T e il test chi-quadrato saranno utilizzati per l'analisi quantitativa e qualitativa, mentre il metodo Mantel-Haenzel sarà utilizzato per calcolare il rischio relativo di esiti diversi (mortalità, intubazione, ecc.) tra i due gruppi. Per identificare i potenziali fattori di rischio associati alla riattivazione del CMV e all'esito clinico, verrà eseguita un'analisi di regressione logistica utilizzando il programma statistico SAS v.9.

Calcolo del campione Per calcolare la dimensione del campione dello studio è stato utilizzato il programma statistico EpiInfo versione 6. Sulla base di dati recenti di adulti, il 30% può dimostrare la riattivazione del CMV mentre si trova in terapia intensiva. Si stima che il tasso di mortalità nelle unità di terapia intensiva pediatrica e per adulti raggiunga rispettivamente l'8% e il 63% circa. Dati recenti suggeriscono che la riattivazione del CMV è associata ad un aumento della mortalità (RR=1,93) e della morbilità (RR=5,70). La dimensione del campione è stata calcolata per soddisfare i criteri dell'intervallo di confidenza del 99% e del potere statistico del 90%. Abbiamo stimato che la nostra popolazione CMV (+) dovrebbe includere 165 bambini e 109 adulti.

I pacchetti di lavoro WP1 e WP2 riguardano la ricerca clinica; arruolamento e follow-up clinico rispettivamente di bambini e adulti. Tutta la raccolta dei dati verrà inserita in un database anonimo che includerà dati demografici, storia passata, valutazione clinica e di laboratorio, gestione clinica e interventi al momento del ricovero e durante il periodo di follow-up. Adulti e bambini saranno valutati separatamente. Una volta forniti i risultati del CMV (WP4), i fattori di rischio associati alla riattivazione del CMV e gli esiti clinici avversi, inclusi sia quelli diretti (ad es. polmonite, episodi febbrili ed epatite) e indirettamente associati (es. degenza prolungata in terapia intensiva o ventilazione meccanica e aumento del tasso di infezioni batteriche).

Il WP3 prevede la valutazione dello stress da una ricerca clinica (WP3.1 e WP 3.2) e di base (WP3.3) approccio. I marcatori di stress biochimico saranno valutati al momento del ricovero e il giorno 7 per esaminare la durata dello stress. Verrà presa in considerazione la somministrazione concomitante di farmaci. I marcatori di stress saranno correlati con la riattivazione del CMV e l'esito clinico per esaminare se possono essere utilizzati come fattori di rischio identificabili per la ricerca futura. Nel WP3.3 saranno studiate le vie di segnalazione cellulare dell'infiammazione in un sottogruppo della nostra coorte. In particolare l'interazione dell'attivazione di NFκΒ e la sensibilità del recettore glucocorticoide nelle cellule mononucleate dei pazienti sarà valutata e correlata con la riattivazione e l'esito del CMV.

Il WP4 ​​prevede la rilevazione prospettica e la quantificazione del DNA di CMV in diversi campioni biologici. Tutti i dati saranno inclusi nel database principale e, soprattutto, verrà creata una banca del DNA per l'eventuale rilevamento di altri herpesvirus in futuro.

Il WP5 valuterà le risposte immunitarie specifiche al CMV in un sottogruppo di pazienti. Questi saranno correlati con la malattia sottostante, la riattivazione e lo stress. Inoltre, in futuro verrà formata una banca di supernatanti da quegli esperimenti per misurare le citochine (Luminex).