심한 스트레스 하에서 면역능력이 있는 환자에서 CMV 감염의 재활성화 (RECYSTRESS)

이것은 중환자실에 입원한 CMV 혈청양성 환자(소아 및 성인)에 대한 다기관 전향적 관찰 연구입니다. 3차 교육 병원에 있는 2개의 소아과 및 4개의 성인 ICU 유닛은 각각 48개월 및 36개월 동안 모집할 예정입니다.

연구 계획 ICU 입원 시 환자(그룹 A 및 B)는 포함/제외 기준에 대해 선별되고 서면 동의서를 얻은 후 환자가 등록됩니다. 임상적 중증도는 표준화된 점수 시스템(각각 PRISM III 및 APACHI II)을 사용하여 평가됩니다. 모든 관련 인구 통계, 병력, 임상 프리젠테이션 및 의료 개입이 데이터베이스에 입력됩니다. 지지 치료(수축제 또는 코르티코스테로이드)를 시작하기 전에 스트레스의 생물학적 지표를 결정하기 위해 혈액과 타액을 채취합니다. 혈청 및 전혈은 각각 CMV-IgG 항체 및 CMV-DNA 결정을 위해 수집됩니다. CMV 혈청 음성 환자는 추가 평가에서 제외됩니다. 혈청 양성 환자는 28일 동안 전향적으로 추적될 것입니다. 주간 후속 조치(입원 7일, 14일, 21일 및 28일)에는 임상 및 검사실 평가, 치료 개입 문서화 및 CMV 재활성화 평가(CMV-DNA 검출)가 포함됩니다. 스트레스 마커는 7일째에만 재검사됩니다. 28일째(추적 종료)에 임상 결과가 기록됩니다.

환자의 무작위 하위 집합(어린이 20명 및 성인 20명)에서 염증 및 특정 면역 반응의 세포내 신호 전달 경로를 연구할 것입니다.

실험실 방법

A) CMV에 대한 혈청학: 혈청 CMV-IgG 항체는 병원 혈청학 실험실에서 Enzyme Immunoassay Method(Elisa, Abbott Laboratories)에 의해 측정됩니다.

나) 생물학적 스트레스 지표 추정

B.1. 유리 코르티솔 측정. 하루 세 번(오전 8시, 오후 2시, 오후 8시) 타액 샘플을 채취하여 특수 합성 면봉(Salivetta-Salivette, Sarsted ®)을 사용하여 일주기 패턴 코르티솔 분비를 결정하고 -70oC에 보관합니다. 코르티솔 수치는 전기화학발광 면역측정법(Elecsys Cortisol 시약 키트, ROCHE)으로 결정됩니다.

B.2. 혈장 카테콜아민. 카테콜아민 수치(노르아드레날린, 아드레날린 및 도파민)는 수축 촉진제로 치료를 시작하기 전에 측정됩니다. inotropes를받지 않은 환자의 경우에만 환자가 누운 상태에서 정맥 카테터에서 샘플을 채취합니다. 혈장은 -85oC에서 보관됩니다. 액체 HPLC 역상(고성능 액체 크로마토그래피 - 역상)이 사용됩니다.

B.3. 혈청 TNF-a는 정량적-샌드위치-효소 면역측정법(Elecsys, ROCHE)으로 측정됩니다.

C) 전혈 및 기관지폐포 세척액(BAL, 환기 환자에서)으로부터의 CMV-DNA의 검출 및 정량화. 환자가 28일 이전에 퇴원하는 경우, CMV-DNA 결정을 위해 타액을 수집하기 위해 집에서 타액을 제공하고(가정용 냉장고에 보관) 28일에 반환합니다. 샘플은 -70oC에 보관되며 각 환자의 모든 샘플은 동시에 검사됩니다. DNA 추출 및 실시간 PCR은 상용 키트(Nanogen Advanced Diagnostics)로 수행됩니다. CMV의 MIEA(Major Immediate Early Antigen)를 암호화하는 유전자 영역이 검출됩니다. 모든 PCR 테스트는 그리스 아테네의 Attikon 대학 병원 세포학 연구소(P. Karakitsos 부교수)에서 수행됩니다.

D) 아테네 대학교 생물화학과에서 면역블롯팅으로 전체 세포 및 말초 혈액 림프구의 핵 추출물에서 글루코코르티코이드 수용체(GR) 및 핵 인자 κB(NFκB) 측정을 수행합니다(Ass. P. Moutsatsou 교수)8

E) CMV에 대한 특이적 면역 반응. CMV 폴리펩티드(pp65 항원 포함)로 시험관내 자극 후 말초 혈액으로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 특이적 면역 반응을 세포내 염색(세포내 염색, ICS)으로 연구할 것이다. CD4+(CFSE)의 증식 및 CD8+(퍼포린 및 그랜자임 B)의 세포독성을 평가할 것이다.

통계 분석 데이터 분석을 위해 성인과 어린이를 별도로 검사합니다. CMV 재활성화가 없는 혈청 양성 환자가 대조군으로 사용됩니다. ≤0.05의 p-값(p)은 통계적 유의성에 대한 기준입니다. 정량적, 정성적 분석은 T-검정과 카이제곱 검정을 사용하고, 두 집단 간의 다른 결과(사망률, 삽관 등)의 상대적 위험도를 계산하기 위해 Mantel-Haenzel 방법을 사용한다. CMV 재활성화 및 임상적 결과와 관련된 잠재적 위험인자를 파악하기 위해 통계 프로그램 SAS v.9를 이용한 로지스틱 회귀 분석을 수행한다.

샘플 계산 연구 샘플 크기를 계산하기 위해 통계 프로그램 EpiInfo 버전 6을 사용했습니다. 성인의 최근 데이터에 따르면 ICU에 있는 동안 30%가 CMV 재활성화를 보일 수 있습니다. 소아 및 성인 ICU의 사망률은 각각 약 8% 및 63%에 이르는 것으로 추정됩니다. 최근 데이터에 따르면 CMV 재활성화는 사망률(RR=1,93) 및 이환율(RR=5,70) 증가와 관련이 있습니다. 표본 크기는 99% 신뢰 구간과 90% 통계 검정력 기준을 충족하도록 계산되었습니다. 우리는 CMV(+) 인구에 어린이 165명과 성인 109명이 포함되어야 한다고 추정했습니다.

작업 패키지 WP1 및 WP2는 임상 연구를 포함합니다. 각각 어린이와 성인의 등록 및 임상 추적. 모든 데이터 수집은 인구통계학적 데이터, 과거 병력, 임상 및 검사실 평가, 임상 관리 및 입원 시 및 후속 조치 기간 동안의 개입을 포함하는 익명의 데이터베이스에 입력됩니다. 성인과 어린이는 별도로 평가됩니다. CMV 결과가 제공되면(WP4) CMV 재활성화와 관련된 위험 요인 및 직접적 요인(즉, 폐렴, 열성 에피소드 및 간염) 및 간접적으로 관련(즉, 연장된 ICU 체류 또는 기계 환기, 박테리아 감염률 증가)를 검사합니다.

WP3에는 임상(WP3.1 및 WP 3.2) 및 기초 연구(WP3.3)의 스트레스 평가가 포함됩니다. 접근하다. 생화학적 스트레스 마커는 입원 시와 7일째에 평가되어 스트레스 지속 시간을 조사합니다. 수반되는 약물 투여가 고려될 것입니다. 스트레스 마커는 CMV 재활성화 및 임상 결과와 상관 관계가 있어 향후 연구에서 식별 가능한 위험 요소로 사용할 수 있는지 여부를 검토할 것입니다. WP3.3에서는 코호트의 하위 집합에서 염증의 세포 신호 전달 경로를 연구할 것입니다. 구체적으로 환자의 단핵 세포에서 NFκB 활성화와 글루코코르티코이드 수용체 감수성의 상호작용을 평가하고 CMV 재활성화 및 결과와 연관시킬 것이다.

WP4는 다양한 생물학적 샘플에서 CMV-DNA의 전향적 검출 및 정량화를 포함합니다. 모든 데이터는 메인 데이터베이스에 포함될 것이며 더 중요한 것은 미래에 다른 헤르페스바이러스의 가능한 검출을 위해 DNA 은행이 형성될 것이라는 점입니다.

WP5는 일부 환자에서 CMV에 대한 특정 면역 반응을 평가할 것입니다. 이들은 기저 질환, 재활성화 및 스트레스와 상관관계가 있습니다. 또한, 이러한 실험에서 얻은 상등액 뱅크는 향후 사이토카인(Luminex)을 측정하기 위해 형성될 것입니다.