上咽頭癌を治療するための EBV-LMP1 標的化 DNAzyme の臨床研究 (NPC-DZ)

はじめに 上咽頭癌 (NPC) は、世界中で深刻な健康問題であり、特に中国南部の人口において、10 万人あたり 15 から 50 の範囲の発生率があります。 NPC は、顕著な人種的および地理的分布の違いを持つ上皮性悪性腫瘍です。 中国南東部の人口で高い発生率が観察されており、シンガポール、台湾、香港を含む移住先のどこにいても、これらの人々で同様の発生率が報告されています. この発生率は、白人集団のほぼ 100 倍です。 NPC の最もユニークな特徴は、エプスタイン-バーウイルス (EBV) の感染とほぼ普遍的に関連していることです。EBV は、いくつかの悪性腫瘍の病因に関与することが確認された最初のヒトウイルスであり、EBV として NPC と特に密接な関連があります。ゲノムは事実上すべての NPC 細胞で検出できます。 放射線療法は NPC の第一選択治療でしたが、放射線耐性は NPC 放射線療法の重要な臨床的問題のままです。 したがって、NPC 治療のための新しい放射線増感剤を発見および開発するという医療ニーズは満たされていません。

NPC における EBV 感染は、EBV 核抗原 1 (EBNA-1)、潜在膜タンパク質 1 (LMP1)、LMP2、および EBV 初期 RNA (EBER) の発現のみを検出できる II 型潜伏感染に分類されます。 これらのタンパク質の中で、LMP1 は NPC の病因において重要な役割を果たしていると考えられています。 60kD の内在性膜タンパク質として、LMP1 は構成的に活性な腫瘍壊死因子受容体 (TNFR) として機能し、核因子 NF-κB、活性化タンパク質-1(AP-1 ）、およびヤヌスキナーゼ/シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子（JAK / STAT）。 LMP1 による NF-kB または AP-1 の活性化は、いくつかの細胞タンパク質のアップレギュレーションおよびアポトーシスの阻害に関連しています。 細胞の種類に応じて、LMP1 の発現は生物学的および生理学的刺激に応答して異なる役割を果たすことが示されています。 これは、ヒト細胞の不死化の主要な腫瘍タンパク質として機能し、齧歯類の線維芽細胞株、ヒト上皮細胞、ケラチノ サイトを形質転換できる唯一の EBV コード製品としても示されています。

形質転換とアポトーシスにおけるウイルス腫瘍タンパク質の重要な役割を考えると、いくつかのウイルス腫瘍タンパク質の抑制は、NPCを遺伝的に治療するための賢明な戦略を提供します。 実際、LMP1 または EBNA1 に対するアンチセンス オリゴヌクレオチドは、ウイルスの腫瘍性タンパク質の発現を阻害し、アポトーシスを誘導し、EBV 陽性細胞を細胞毒性物質に対して感作することが示されています。 最近、いくつかの実験的研究は、LMP1 に対する RNA 干渉が、LMP1 を発現する NPC で抗増殖および抗転移効果を示すことを示しました。 これらの結果は、EBV にコードされた LMP1 が EBV 関連癌の治療のための潜在的な分子標的を提示する可能性があることを示唆しています。

DNAzymes は合成の一本鎖 DNA オリゴヌクレオチドであり、ワトソン-クリック塩基対を介して標的メッセンジャー RNA (mRNA) の相補配列に結合し、mRNA を所定のホスホジエステル結合で切断するように操作できます。 DNAzyme の一般的なモデルが提案されており、「10-23」モデルとして知られています。 「10-23」DNAzyme は、15 個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを持ち、各アームに 7 ～ 9 個のデオキシリボヌクレオチドの 2 つの基質認識ドメインが隣接しています。 インビトロ分析は、このタイプの DNAzyme が生理学的条件下でプリン: ピリミジン接合部でその基質 RNA を効果的に切断できることを示しました。 これらの薬剤は、それらの標的遺伝子および依存性遺伝子の発現を阻害するために、多くのインビトロおよびインビボ用途で使用されてきました。 動物モデルにおける多様な病態の発生をブロックする能力は、DNAzymes が治療薬として使用できることを示唆しています。

NPC 治療用の EBV-LMP1 標的化 DNAzyme を開発するために、LMP1 mRNA を特異的に標的とするホスホロチオエート修飾 ''10-23'' DNAzymes が、鼻咽頭癌細胞 (NPC) における LMP1 の発現を有意にダウンレギュレートできることを示しました。 NF-κB経路を含む、LMP1によって活性化される下流経路に影響を与えました。 また、LMP1 を標的とする DNAzyme DZ1 による LMP1 発現の抑制が、in vivo と in vitro の両方で放射線感受性を高めることができることも実証されました。 放射線耐性は、効果的ながん治療の臨床現場における障害の 1 つであり、さまざまな種類のがんにおける複数のシグナル伝達経路に関連していると考えられています。 ATM (毛細血管拡張性運動失調症変異) は、カルボキシル末端ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ様キナーゼ ドメインを持つ核の 350 kDa タンパク質キナーゼです [1]。 これは、DNA 切断を検出する協調システムのメンバーとして機能します。 G1、S、または G2 チェックポイントでセルを一時的に停止します。 DNA修復を活性化します。 機能的な ATM タンパク質を欠く細胞は、電離放射線 (IR) およびその他の遺伝毒性事象に対する感受性の増加を示します。 NF-κB (核因子カッパ B) は、ストレス応答、炎症、およびプログラム細胞死 (アポトーシス) に関与する多数の遺伝子を活性化できます。 P50 ホモ二量体または p50/p65 または p50/c-Rel ヘテロ二量体は、多くのストレス応答遺伝子のプロモーター領域にある NF-κB DNA 結合部位に結合し、ストレス応答において NF-κB によって制御される複雑な遺伝子および生理学的調節ネットワークを示唆しています。 特定の癌における基礎NF-κB活性の上昇は、化学療法および放射線に対する腫瘍の抵抗性に関連しています。 NF-κBの阻害は、適応放射線耐性をブロックしました。 LMP1-DNAzyme を介した放射線増感の分子メカニズムに関する我々の研究により、LMP1 が NF-κB 経路を介して ATM 発現を活性化し、DNAzyme による LMP1 発現の阻害が NF-κB 転写因子の ATM プロモーターへの結合を弱めることが明らかになりました。 さらなる証拠は、ATM 発現が NPC の siRNA によってノックダウンされると、放射線感受性が回復したことを示しました。 まとめると、私たちのすべてのデータは私たちの仮説を支持し、EBV 関連癌の治療のための潜在的な放射線増感剤として LMP1 を標的とする DNAzyme を使用するための確固たる実験的根拠を提供します。

マウスの毒物学的研究では、研究期間中、どの投与群でも罹患率や死亡率は観察されなかったことが示されました (50mg、100mg、および 200mg/kg)。 肝機能および腎機能の検査によるすべての血液学的値および生化学的結果は正常でした。 修飾された DNAzyme オリゴヌクレオチド処理に起因する可能性のある顕微鏡的病変は、どのグループの肝臓、脾臓、および腎臓にも見られませんでした。 静脈内投与後 マウスに 100 mg/kg の DNAzyme オリゴヌクレオチドを投与した場合、ピーク血漿濃度は 24.13±2.6 μg/ml が達成された。 DNAzyme の血漿濃度の減少は、初期分布半減期 (t1/2α) が 0.18±0.03 の双指数パターンに従いました。 h および 2.55±1.0 の終末半減期 (t1/2β) h、および血漿濃度-時間曲線下面積（AUC）は54.17±9.1μg.h / mlでした。

研究デザイン この研究は、無作為化、二重盲検、プラセボ対照のフェーズ I/II 臨床試験です。 40 人の患者は、同じサイズの 2 つのグループのいずれかに無作為に割り付けられます。またはLMP1 DNAzyme（DZ1）および標準的な放射線療法を受けているDZ1グループ。 プラセボ グループは、DZ1 の安全性と有効性の評価の基礎を提供します。

患者は、根治的放射線療法の 2 時間前にプラセボまたは DZ1 注射を月曜日と木曜日に 7 週間にわたって受けます。 根治的放射線療法は、各治療の 2 Gy で週 5 回患者に与えられます。 手順全体は7週間続きます。

すべての患者は、最初の注射後 104 週間で研究を完了します。 患者は、最初の 7 週間は毎週評価と検査を受け、その後 8 週間から 104 週間までは 3 か月ごとに検査を受けます。

この研究には、安全性と忍容性の評価が含まれます。