Klinisk studie av EBV-LMP1-riktat DNAzym för behandling av nasofarynxkarcinom (NPC-DZ)

INLEDNING Nasofarynxkarcinom (NPC) är ett allvarligt hälsoproblem över hela världen, särskilt i den södra kinesiska befolkningen, med en incidens på mellan 15 och 50 per 100 000. NPC är en epitelial malignitet med en slående rasmässig och geografisk fördelningsskillnad. Höga incidensfrekvenser observeras i den sydöstkinesiska befolkningen, och liknande siffror har rapporterats hos dessa människor vart de än har migrerat, inklusive Singapore, Taiwan och Hong Kong. Denna förekomst är nästan 100 gånger högre än i vita populationer. Den mest unika egenskapen hos NPC är dess nästan universella associering med infektionen av Epstein-Barr-virus (EBV), som är det första humana viruset som identifierats vara involverat i patogenesen av flera maligniteter och har en särskilt nära koppling till NPC, som EBV genomet kan detekteras i praktiskt taget alla NPC-celler. Medan strålbehandling har varit förstahandsbehandlingen för NPC, är radioresistens fortfarande en betydande klinisk fråga för NPC-strålbehandlingen. Det finns således otillfredsställda medicinska behov för att upptäcka och utveckla nya radiosensibilisatorer för NPC-terapi.

EBV-infektion i NPC klassificeras som latent typ II-infektion där endast uttryck av EBV nukleärt antigen-1(EBNA-1), latent membranprotein-1(LMP1), LMP2 och EBV tidigt RNA (EBER) kan detekteras. Bland dessa proteiner tros LMP1 spela en nyckelroll i patogenesen av NPC. Som ett 60 kD integrerat membranprotein fungerar LMP1 som en konstitutivt aktiv tumörnekrosfaktorreceptor (TNFR) och bidrar till flera aspekter av NPC genom att aktivera ett antal signalvägar inklusive kärnfaktor NF-KB, aktivatorprotein-1 (AP-1) ), och Janus kinas/signalomvandlare och aktivator av transkription (JAK/STAT). Aktivering av NF-kB eller AP-1 av LMP1 har kopplats till uppreglering av vissa cellulära proteiner och hämning av apoptos. Beroende på celltyperna har uttryck av LMP1 visat sig spela olika roller som svar på biologisk och fysiologisk stimulans. Det fungerar som ett primärt onkoprotein för immortalisering av mänskliga celler och visas också som den enda EBV-kodade produkten som kan transformera fibroblastcellinjer från gnagare, humana epitelceller och keratinocyter.

Med tanke på den kritiska rollen av virala onkoproteiner i transformation och apoptos, skulle suppression av vissa virala onkoproteiner ge en vettig strategi för att genetiskt behandla NPC. I själva verket har antisensoligonukleotider mot LMP1 eller EBNA1 visat sig hämma viralt onkoproteinuttryck, inducera apoptos och sensibilisera de EBV-positiva cellerna för cytotoxiska medel. Nyligen indikerade några experimentella studier att RNA-interferensen mot LMP1 uppvisade en anti-proliferativ och anti-metastaseffekt i LMP1-uttryckande NPC:er. Dessa resultat antydde att EBV-kodad LMP1 kan utgöra ett potentiellt molekylärt mål för behandling av EBV-associerade karcinom.

DNAzymer är syntetiska, enkelsträngade DNA-oligonukleotider som kan konstrueras för att binda till sin komplementära sekvens i ett målbudbärar-RNA (mRNA) genom Watson-Crick-basparning och klyva mRNA:t vid förutbestämda fosfodiesterkopplingar. En allmän modell för DNAzyme har föreslagits, och är känd som ''10-23''-modellen. Ett ''10-23'' DNAzyme har en katalytisk domän av 15 deoxiribonukleotider, flankerad av två substratigenkännande domäner med sju till nio deoxiribonukleotider vid varje arm. In vitro-analyser visade att denna typ av DNAzym effektivt kunde klyva dess substrat-RNA vid purin: pyrimidin-övergångar under fysiologiska förhållanden. Dessa medel har använts i ett antal in vitro- och in vivo-applikationer för att hämma uttrycket av deras målgener och de beroende generna. Deras förmåga att blockera utvecklingen av en mängd olika patologier i djurmodeller tyder på att DNAzymer kan användas som terapeutiska medel.

För att utveckla EBV-LMP1-riktade DNAzymer för NPC-behandling, visade vi att de fosfortioat-modifierade ''10-23'' DNAzymerna specifikt riktade mot LMP1-mRNA kunde signifikant nedreglera uttrycket av LMP1 i en nasofaryngeal karcinomcell (NPC) och påverkade nedströmsvägarna aktiverade av LMP1, inklusive NF-KB-vägen. Det visades också att undertryckande av LMP1-uttrycket av det LMP1-riktade DNAzyme DZ1 kunde öka strålkänsligheten både in vivo och vitro. Radioresistens har varit ett av hindren i kliniska miljöer för effektiv cancerterapi, som tros vara associerad med flera signalvägar i olika cancertyper. ATM (ataxia telangiectasia mutated) är ett nukleärt 350 kDa proteinkinas med en karboxylterminal fosfatidylinositol 3-kinasliknande kinasdomän[1]. Den fungerar som en medlem av ett koordinerat system som upptäcker DNA-avbrott; arresterar cellerna tillfälligt vid G1-, S- eller G2-kontrollpunkter; och aktiverar DNA-reparation. Celler som saknar funktionellt ATM-protein visar ökad känslighet för joniserande strålning (IR) och andra genotoxiska händelser. NF-KB (kärnfaktor kappa B) kan aktivera ett stort antal gener involverade i stressreaktioner, inflammation och programmerad celldöd (apoptos). P50-homodimerer eller p50/p65- eller p50/c-Rel-heterodimerer binder till NF-KB-DNA-bindningsställena i promotorregionerna av många stressresponsiva gener, vilket tyder på ett komplext gen- och fysiologiskt regleringsnätverk som kontrolleras av NF-KB i stressrespons. Den förhöjda basala NF-KB-aktiviteten i vissa cancerformer har kopplats till tumörresistens mot kemoterapi och strålning. Hämning av NF-KB blockerade den adaptiva radioresistensen. Våra studier för den molekylära mekanismen för LMP1-DNAzyme-medierad radiosensibilisering avslöjade att LMP1 aktiverade ATM-uttrycket genom NF-KB-vägen och inhibering av LMP1-uttryck av DNAzyme försvagade bindningen av NF-KB-transkriptionsfaktor till ATM-promotorn. Ytterligare bevis visade att strålkänsligheten återvanns när ATM-uttrycket slogs ner av siRNA i NPC:er. Tillsammans stödjer alla våra data vår hypotes och ger en solid experimentell grund för användningen av LMP1-riktade DNAzymer som potentiella radiosensibilisatorer för behandling av EBV-associerade karcinom.

Toxikologiska studier på möss visade att ingen morbiditet eller mortalitet observerades i någon av doseringsgrupperna under studiens gång (50 mg, 100 mg och 200 mg/kg). Alla hematologiska värden och biokemiresultat från tester av lever- och njurfunktion var normala. Ingen mikroskopisk lesion som kunde tillskrivas den modifierade DNAzyme-oligonukleotidbehandlingen hittades i lever, mjälte och njure i någon grupp. Efter i.v. administrering av 100 mg/kg DNAzyme-oligonukleotid i möss, toppplasmakoncentrationen på 24,13±2,6μg/ml uppnåddes. Minskningen av plasmakoncentrationen av DNAzyme följde ett bi-exponentiellt mönster med initial halveringstid (t1/2α) på 0,18±0,03 h och en terminal halveringstid (t1/2β) på 2,55±1,0 h, och arean under plasmakoncentration-tidkurvan (AUC) var 54,17±9,1μg.h/ml.

STUDIEDESIGN Denna studie kommer att vara en randomiserad, dubbelblind och placebokontrollerad klinisk fas I/II-studie. Fyrtio (40) patienter kommer att randomiseras till en av två grupper av samma storlek: placebogrupp som får koksaltlösning genom intratumörinjektion och standardstrålbehandling; eller DZ1-grupp som får LMP1 DNAzyme (DZ1) och standardstrålbehandling. Placebogruppen kommer att utgöra grunden för bedömning av säkerhet och effekt av DZ1.

Patienterna får placebo- eller DZ1-injektion två (2) timmar före radikal strålbehandling på måndag och torsdag under sju veckor. Den radikala strålbehandlingen ges till patienter 5 gånger i veckan med 2 Gy av varje behandling. Hela proceduren varar i sju veckor.

Alla patienter kommer att slutföra studien 104 veckor efter den första injektionen. Patienterna kommer att genomgå bedömning och testning varje vecka under de första sju veckorna, sedan var tredje månad från vecka 8 till vecka 104.

Studien kommer att omfatta utvärderingar av säkerhet och tolerabilitet: