Клиническое исследование ДНКзима, нацеленного на EBV-LMP1, для лечения карциномы носоглотки (NPC-DZ)

ВВЕДЕНИЕ Рак носоглотки (РНГ) представляет собой серьезную проблему со здоровьем во всем мире, особенно среди населения южного Китая, с частотой заболеваемости от 15 до 50 на 100 000 населения. NPC представляет собой эпителиальное злокачественное новообразование с поразительными расовыми и географическими различиями в распространении. Высокие показатели заболеваемости наблюдаются среди населения юго-востока Китая, и аналогичные показатели были зарегистрированы у этих людей, где бы они ни мигрировали, включая Сингапур, Тайвань и Гонконг. Эта заболеваемость почти в 100 раз выше, чем у белого населения. Наиболее уникальной особенностью РНГ является его почти универсальная связь с инфекцией вирусом Эпштейна-Барра (ВЭБ), который является первым вирусом человека, который, как установлено, участвует в патогенезе нескольких злокачественных новообразований и имеет особенно тесную связь с РНГ, как ВЭБ. геном можно обнаружить практически во всех клетках NPC. В то время как лучевая терапия была лечением первой линии для NPC, радиорезистентность остается серьезной клинической проблемой для радиотерапии NPC. Таким образом, существуют неудовлетворенные потребности медицины в открытии и разработке новых радиосенсибилизаторов для терапии NPC.

ВЭБ-инфекция при РНГ классифицируется как латентная инфекция типа II, при которой могут быть обнаружены только экспрессия ядерного антигена-1 ВЭБ (EBNA-1), латентного мембранного белка-1 (LMP1), LMP2 и ранней РНК ВЭБ (EBER). Считается, что среди этих белков ключевую роль в патогенезе NPC играет LMP1. Являясь интегральным мембранным белком массой 60 кДа, LMP1 функционирует как конститутивно активный рецептор фактора некроза опухоли (TNFR) и вносит вклад во многие аспекты NPC посредством активации ряда сигнальных путей, включая ядерный фактор NF-κB, белок-активатор-1 (AP-1). ), и янус-киназа/преобразователь сигнала и активатор транскрипции (JAK/STAT). Активация NF-kB или AP-1 с помощью LMP1 была связана с активацией некоторых клеточных белков и ингибированием апоптоза. Было показано, что в зависимости от типов клеток экспрессия LMP1 играет разные роли в ответ на биологические и физиологические стимулы. Он действует как первичный онкопротеин для иммортализации клеток человека, а также показан как единственный продукт, кодируемый EBV, который может трансформировать клеточную линию фибробластов грызунов, эпителиальные клетки человека и кератиноциты.

Учитывая критическую роль вирусных онкопротеинов в трансформации и апоптозе, подавление некоторых вирусных онкопротеинов могло бы обеспечить разумную стратегию генетического лечения NPC. Действительно, было показано, что антисмысловые олигонуклеотиды против LMP1 или EBNA1 ингибируют экспрессию вирусного онкопротеина, индуцируют апоптоз и повышают чувствительность EBV-позитивных клеток к цитотоксическим агентам. Недавно некоторые экспериментальные исследования показали, что РНК-интерференция против LMP1 проявляла антипролиферативный и антиметастазный эффект в NPC, экспрессирующих LMP1. Эти результаты позволяют предположить, что LMP1, кодируемый EBV, может представлять собой потенциальную молекулярную мишень для лечения EBV-ассоциированных карцином.

ДНКзимы представляют собой синтетические одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды, которые можно сконструировать таким образом, чтобы они связывались с их комплементарной последовательностью в целевой матричной РНК (мРНК) посредством спаривания оснований Уотсона-Крика и расщепляли мРНК по заранее определенным фосфодиэфирным связям. Была предложена общая модель ДНКзима, известная как модель «10-23». ДНКзим ''10-23'' имеет каталитический домен из 15 дезоксирибонуклеотидов, окруженный двумя доменами распознавания субстрата из семи-девяти дезоксирибонуклеотидов в каждом плече. Анализы in vitro показали, что этот тип DNAzyme может эффективно расщеплять свою субстратную РНК в пуриновых: пиримидиновых соединениях в физиологических условиях. Эти агенты использовались в ряде приложений in vitro и in vivo для ингибирования экспрессии их генов-мишеней и зависимых генов. Их способность блокировать развитие разнообразных патологий на животных моделях позволяет предположить, что ДНКзимы можно использовать в качестве терапевтических агентов.

Чтобы разработать ДНК-зимы, нацеленные на EBV-LMP1, для лечения NPC, мы показали, что модифицированные фосфоротиоатом ДНКзимы «10-23», специально нацеленные на мРНК LMP1, могут значительно подавлять экспрессию LMP1 в клетке карциномы носоглотки (NPC) и влияет на нижестоящие пути, активируемые LMP1, включая путь NF-κB. Также было продемонстрировано, что подавление экспрессии LMP1 ДНКзимом DZ1, нацеленным на LMP1, может повышать радиочувствительность как in vivo, так и in vitro. Радиорезистентность была одним из препятствий в клинических условиях для эффективной терапии рака, которая, как считается, связана с несколькими сигнальными путями при различных типах рака. ATM (ataxia telangiectasia mutated) представляет собой ядерную протеинкиназу массой 350 кДа с карбоксиконцевым фосфатидилинозитол-3-киназным доменом [1]. Он функционирует как член скоординированной системы, обнаруживающей разрывы ДНК; временно арестовывает камеры на контрольно-пропускных пунктах G1, S или G2; и активирует репарацию ДНК. Клетки, лишенные функционального белка ATM, проявляют повышенную чувствительность к ионизирующему излучению (IR) и другим генотоксическим явлениям. NF-κB (ядерный фактор каппа B) может активировать большое количество генов, участвующих в реакциях на стресс, воспалении и запрограммированной гибели клеток (апоптозе). Гомодимеры P50 или гетеродимеры p50/p65 или p50/c-Rel связываются с сайтами связывания ДНК NF-kB в промоторных областях многих генов, чувствительных к стрессу, что указывает на сложную сеть генов и физиологической регуляции, контролируемую NF-kB в ответ на стресс. Повышенная базальная активность NF-κB при некоторых видах рака была связана с резистентностью опухоли к химиотерапии и облучению. Ингибирование NF-κB блокировало адаптивную радиорезистентность. Наши исследования молекулярного механизма радиосенсибилизации, опосредованной LMP1-ДНКзимом, показали, что LMP1 активировал экспрессию ATM через путь NF-κB, а ингибирование экспрессии LMP1 ДНКзимом ослабляло связывание транскрипционного фактора NF-κB с промотором ATM. Дальнейшие данные показали, что радиочувствительность восстанавливалась, когда экспрессия ATM подавлялась siRNA в NPC. В совокупности все наши данные подтверждают нашу гипотезу и обеспечивают прочную экспериментальную основу для использования ДНКзимов, нацеленных на LMP1, в качестве потенциальных радиосенсибилизаторов для лечения EBV-ассоциированных карцином.

Токсикологические исследования на мышах показали, что в ходе исследования ни в одной из групп дозирования (50 мг, 100 мг и 200 мг/кг) не наблюдалось заболеваемости или смертности. Все гематологические показатели и результаты биохимии тестов функции печени и почек были нормальными. В печени, селезенке и почках ни в одной из групп не было обнаружено микроскопических повреждений, которые можно было бы отнести к обработке модифицированным олигонуклеотидом ДНКзима. После и.в. введение 100 мг/кг олигонуклеотида ДНКзима мышам, пиковая концентрация в плазме 24,13±2,6 мкг/мл была достигнута. Снижение концентрации ДНКзима в плазме происходило по биэкспоненциальной схеме с начальным периодом полувыведения распределения (t1/2α) 0,18±0,03. ч и конечный период полувыведения (t1/2β) 2,55±1,0 ч, а площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC) составила 54,17±9,1 мкг·ч/мл.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Это исследование будет рандомизированным двойным слепым и плацебо-контролируемым клиническим испытанием фазы I/II. Сорок (40) пациентов будут рандомизированы в одну из двух групп равного размера: группа плацебо, получающая физиологический раствор путем внутриопухолевой инъекции и стандартная лучевая терапия; или группу DZ1, получающую LMP1 DNAzyme (DZ1) и стандартную лучевую терапию. Группа плацебо послужит основой для оценки безопасности и эффективности DZ1.

Пациенты получают плацебо или инъекцию DZ1 за два (2) часа до радикальной лучевой терапии в понедельник и четверг в течение семи недель. Радикальная лучевая терапия проводится пациентам 5 раз в неделю по 2 Гр на каждый сеанс. Вся процедура длится семь недель.

Все пациенты завершат исследование через 104 недели после первой инъекции. Пациенты будут проходить обследование и тестирование каждую неделю в течение первых семи недель, а затем каждые три месяца с 8-й по 104-ю неделю.

Исследование будет включать оценку безопасности и переносимости: