Kliininen tutkimus EBV-LMP1:lle kohdistetusta DNA-tsyymistä nenänielun karsinooman hoitoon (NPC-DZ)

JOHDANTO Nenänielun syöpä (NPC) on vakava terveysongelma maailmanlaajuisesti, erityisesti Etelä-Kiinan väestössä, ja sen ilmaantuvuus vaihtelee 15-50 tapauksesta 100 000:ta kohti. NPC on epiteelin pahanlaatuinen kasvain, jolla on silmiinpistäviä rodullisia ja maantieteellisiä eroja. Kaakkois-Kiinan väestössä havaitaan korkea ilmaantuvuus, ja samankaltaisia ​​määriä on raportoitu näillä ihmisillä minne tahansa he ovat muuttaneet, mukaan lukien Singaporessa, Taiwanissa ja Hongkongissa. Tämä ilmaantuvuus on lähes 100 kertaa suurempi kuin valkoisissa populaatioissa. NPC:n ainutlaatuisin ominaisuus on sen lähes yleinen yhteys Epstein-Barr-viruksen (EBV) infektioon, joka on ensimmäinen ihmisen virus, jonka on tunnistettu osallistuvan useiden pahanlaatuisten kasvainten patogeneesiin ja jolla on erityisen läheinen yhteys NPC:hen, kuten EBV:hen. genomi voidaan havaita käytännössä kaikista NPC-soluista. Vaikka sädehoito on ollut NPC-sädehoidon ensilinjan hoitomuoto, säteilyresistenssi on edelleen merkittävä kliininen ongelma NPC-sädehoidossa. Siten on olemassa täyttämättömiä lääketieteellisiä tarpeita löytää ja kehittää uusia radioherkistäviä aineita NPC-hoitoon.

EBV-infektio NPC:ssä luokitellaan tyypin II piileväksi infektioksi, jossa voidaan havaita vain EBV:n tumaantigeeni-1:n (EBNA-1), latentin kalvoproteiini-1:n (LMP1), LMP2:n ja EBV:n varhaisen RNA:n (EBER) ilmentymät. Näistä proteiineista LMP1:llä uskotaan olevan keskeinen rooli NPC:n patogeneesissä. 60 kD:n integroituna kalvoproteiinina LMP1 toimii konstitutiivisesti aktiivisena tuumorinekroositekijäreseptorina (TNFR) ja myötävaikuttaa NPC:n moniin aspekteihin aktivoimalla useita signalointireittejä, mukaan lukien ydintekijä NF-KB, aktivaattoriproteiini-1 (AP-1). ) ja Janus-kinaasi/signaalimuunnin ja transkription aktivaattori (JAK/STAT). LMP1:n aiheuttama NF-kB:n tai AP-1:n aktivointi on yhdistetty joidenkin soluproteiinien lisääntymiseen ja apoptoosin estoon. Solutyypeistä riippuen LMP1:n ilmentymisellä on osoitettu olevan erilaisia ​​rooleja vasteena biologisille ja fysiologisille ärsykkeille. Se toimii ensisijaisena onkoproteiinina ihmisen solujen immortalisoinnissa, ja se on myös esitetty ainoana EBV-koodaamana tuotteena, joka voi muuttaa jyrsijän fibroblastisolulinjaa, ihmisen epiteelisoluja ja keratinosyyttejä.

Kun otetaan huomioon virusten onkoproteiinien kriittinen rooli transformaatiossa ja apoptoosissa, joidenkin virusonkoproteiinien suppressio tarjoaisi järkevän strategian NPC:n geneettiseen hoitoon. Todellakin, antisense-oligonukleotidien LMP1:tä tai EBNA1:tä vastaan ​​on osoitettu estävän viruksen onkoproteiinin ilmentymistä, indusoivan apoptoosia ja herkistävän EBV-positiivisia soluja sytotoksisille aineille. Äskettäin jotkut kokeelliset tutkimukset osoittivat, että RNA-interferenssi LMP1:tä vastaan ​​osoitti proliferaatiota ja etäpesäkkeitä estävää vaikutusta LMP1:tä ilmentävissä NPC:issä. Nämä tulokset viittasivat siihen, että EBV:n koodaama LMP1 voi olla mahdollinen molekyylikohde EBV:hen liittyvien karsinoomien hoidossa.

DNAtsyymit ovat synteettisiä, yksijuosteisia DNA-oligonukleotideja, jotka voidaan muokata sitoutumaan komplementaariseen sekvenssiinsä kohdelähetti-RNA:ssa (mRNA) Watson-Crick-emäspariutumisen kautta ja katkaisemaan mRNA:n ennalta määrätyistä fosfodiesterisidoksista. DNAzymelle on ehdotettu yleistä mallia, ja se tunnetaan nimellä "10-23" malli. "10-23" DNAtsyymillä on 15 deoksiribonukleotidin katalyyttinen domeeni, jota reunustavat kaksi 7-9 deoksiribonukleotidin substraatin tunnistusdomeenia kummassakin käsivarressa. In vitro -analyysit osoittivat, että tämän tyyppinen DNAtsyymi pystyi tehokkaasti katkaisemaan substraatti-RNA:ta puriini:pyrimidiiniliitoksissa fysiologisissa olosuhteissa. Näitä aineita on käytetty useissa in vitro ja in vivo -sovelluksissa niiden kohdegeenien ja niistä riippuvien geenien ilmentymisen estämiseksi. Niiden kyky estää erilaisten patologioiden kehittyminen eläinmalleissa viittaa siihen, että DNA-tsyymejä voidaan käyttää terapeuttisina aineina.

Kehittääksemme EBV-LMP1:een kohdistettuja DNA-tsyymejä NPC-hoitoa varten osoitimme, että fosforotioaattimodifioidut ''10-23'' DNA-entsyymit, jotka on kohdistettu erityisesti LMP1-mRNA:han, voivat merkittävästi vähentää LMP1:n ilmentymistä nenänielun karsinoomasolussa (NPC) ja vaikutti LMP1:n aktivoimiin alavirran reitteihin, mukaan lukien NF-KB-reitti. Osoitettiin myös, että LMP1:een kohdistetun DNAzyme DZ1:n aiheuttama LMP1-ekspression suppressio voisi lisätä radioherkkyyttä sekä in vivo että vitro. Radioresistenssi on ollut yksi esteistä kliinisissä olosuhteissa tehokkaalle syöpähoidolle, jonka uskotaan liittyvän useisiin signalointireitteihin eri syöpätyypeissä. ATM (ataxia telangiectasia mutated) on tumassa oleva 350 kDa:n proteiinikinaasi, jossa on karboksyyliterminaalinen fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasin kaltainen kinaasidomeeni[1]. Se toimii jäsenenä koordinoidussa järjestelmässä, joka havaitsee DNA-katkoja; pysäyttää solut väliaikaisesti G1-, S- tai G2-tarkastuspisteissä; ja aktivoi DNA:n korjauksen. Solut, joista puuttuu toimiva ATM-proteiini, osoittavat lisääntynyttä herkkyyttä ionisoivalle säteilylle (IR) ja muille genotoksisille tapahtumille. NF-κB (ydintekijä kappa B) voi aktivoida suuren määrän geenejä, jotka osallistuvat stressivasteisiin, tulehdukseen ja ohjelmoituun solukuolemaan (apoptoosiin). P50-homodimeerit tai p50/p65- tai p50/c-Rel-heterodimeerit sitoutuvat NF-KB DNA:n sitoutumiskohtiin monien stressiin reagoivien geenien promoottorialueilla, mikä viittaa monimutkaiseen geeniin ja fysiologiseen säätelyverkostoon, jota NF-KB kontrolloi stressivasteessa. Kohonnut NF-KB:n perusaktiivisuus tietyissä syövissä on yhdistetty kasvaimen vastustuskykyyn kemoterapiaa ja säteilyä vastaan. NF-KB:n esto esti adaptiivisen radioresistenssin. LMP1-DNAzyme-välitteisen radioherkistyksen molekyylimekanismia koskevat tutkimuksemme paljastivat, että LMP1 aktivoi ATM-ilmentymisen NF-KB-reitin kautta ja LMP1-ilmentymisen esto DNAzymellä heikensi NF-KB-transkriptiotekijän sitoutumista ATM-promoottoriin. Lisätodisteet osoittivat, että radioherkkyys palautui, kun siRNA tyrmäsi ATM-ilmentymisen NPC:issä. Yhdessä kaikki tietomme tukevat hypoteesiamme ja tarjoavat vankan kokeellisen perustan LMP1-kohdennettujen DNA-entsyymien käytölle mahdollisina säteilyherkistiminä EBV:hen liittyvien karsinoomien hoidossa.

Toksikologiset tutkimukset hiirillä osoittivat, että sairastuvuutta tai kuolleisuutta ei havaittu missään annosryhmässä tutkimuksen aikana (50 mg, 100 mg ja 200 mg/kg). Kaikki hematologiset arvot ja biokemialliset tulokset maksan ja munuaisten toimintakokeista olivat normaaleja. Maksassa, pernassa ja munuaisissa ei löytynyt mikroskooppisia vaurioita, jotka voitaisiin johtua modifioidusta DNAzyme-oligonukleotidikäsittelystä. i.v. kun annettiin 100 mg/kg DNAzyme-oligonukleotidia hiirille, huippupitoisuus plasmassa oli 24,13±2,6 μg/ml saavutettiin. DNAzymen pitoisuuden lasku plasmassa noudatti bi-eksponentiaalista kuviota alkuperäisen jakautumisen puoliintumisajan (t1/2α) ollessa 0,18 ± 0,03 h ja terminaalinen puoliintumisaika (t1/2β) on 2,55±1,0 h, ja plasman pitoisuus-aikakäyrän alla oleva pinta-ala (AUC) oli 54,17±9,1 μg.h/ml.

TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU Tämä tutkimus on satunnaistettu, kaksoissokkoutettu ja lumekontrolloitu vaiheen I/II kliininen tutkimus. Neljäkymmentä (40) potilasta satunnaistetaan yhteen kahdesta samankokoisesta ryhmästä: lumelääkeryhmä, joka saa suolaliuosta kasvaimensisäisenä injektiona ja tavanomaista sädehoitoa; tai DZ1-ryhmä, joka saa LMP1 DNAzymeä (DZ1) ja tavallista sädehoitoa. Lumeryhmä muodostaa perustan DZ1:n turvallisuuden ja tehon arvioinnille.

Potilaat saavat lumelääkettä tai DZ1-injektiota kaksi (2) tuntia ennen radikaalia sädehoitoa maanantaisin ja torstaisin seitsemän viikon ajan. Radikaalisädehoitoa annetaan potilaille 5 kertaa viikossa 2 Gy:llä jokaista hoitoa kohden. Koko toimenpide kestää seitsemän viikkoa.

Kaikki potilaat suorittavat tutkimuksen 104 viikkoa ensimmäisen injektion jälkeen. Potilaat arvioidaan ja testataan viikoittain ensimmäisten seitsemän viikon aikana, sitten kolmen kuukauden välein viikoilta 8 viikoksi 104.

Tutkimus sisältää turvallisuuden ja siedettävyyden arvioinnit: