Studio clinico del DNAzyme mirato a EBV-LMP1 per il trattamento del carcinoma nasofaringeo (NPC-DZ)

INTRODUZIONE Il carcinoma nasofaringeo (NPC) è un grave problema di salute in tutto il mondo, in particolare nella popolazione della Cina meridionale, con un tasso di incidenza che va da 15 a 50 per 100.000. L'NPC è un tumore epiteliale con notevoli differenze di distribuzione razziale e geografica. Alti tassi di incidenza si osservano nella popolazione della Cina sudorientale e tassi simili sono stati riportati in queste persone ovunque siano migrate, tra cui Singapore, Taiwan e Hong Kong. Questa incidenza è quasi 100 volte superiore rispetto alle popolazioni bianche. La caratteristica più singolare di NPC è la sua associazione quasi universale con l'infezione del virus Epstein-Barr (EBV), che è il primo virus umano identificato per essere coinvolto nella patogenesi di diverse neoplasie e ha un'associazione particolarmente stretta con NPC, come EBV il genoma può essere rilevato praticamente in tutte le cellule NPC. Mentre la radioterapia è stata il trattamento di prima linea per NPC, la radioresistenza rimane un problema clinico significativo per la radioterapia NPC. Pertanto, vi sono esigenze mediche insoddisfatte per scoprire e sviluppare nuovi radiosensibilizzatori per la terapia NPC.

L'infezione da EBV in NPC è classificata come infezione latente di tipo II in cui possono essere rilevate solo le espressioni dell'antigene nucleare EBV-1 (EBNA-1), della proteina di membrana latente-1 (LMP1), LMP2 e dell'RNA precoce EBV (EBER). Tra queste proteine, si ritiene che LMP1 svolga un ruolo chiave nella patogenesi dell'NPC. Come proteina di membrana integrale da 60kD, LMP1 funziona come un recettore del fattore di necrosi tumorale (TNFR) costitutivamente attivo e contribuisce a molteplici aspetti dell'NPC attraverso l'attivazione di una serie di vie di segnalazione tra cui il fattore nucleare NF-κB, l'attivatore della proteina-1 (AP-1 ) e Janus chinasi/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione (JAK/STAT). L'attivazione di NF-kB o AP-1 da parte di LMP1 è stata collegata alla sovraregolazione di alcune proteine ​​cellulari e all'inibizione dell'apoptosi. A seconda dei tipi cellulari, è stato dimostrato che l'espressione di LMP1 svolge ruoli diversi in risposta a stimoli biologici e fisiologici. Agisce come oncoproteina primaria per l'immortalizzazione delle cellule umane ed è anche indicato come l'unico prodotto codificato da EBV in grado di trasformare la linea cellulare di fibroblasti di roditori, cellule epiteliali umane e cheratinociti.

Dato il ruolo critico delle oncoproteine ​​virali nella trasformazione e nell'apoptosi, la soppressione di alcune oncoproteine ​​virali fornirebbe una strategia ragionevole per trattare geneticamente NPC. Infatti, è stato dimostrato che gli oligonucleotidi antisenso contro LMP1 o EBNA1 inibiscono l'espressione dell'oncoproteina virale, inducono l'apoptosi e sensibilizzano le cellule EBV-positive agli agenti citotossici. Recentemente, alcuni studi sperimentali hanno indicato che l'interferenza dell'RNA contro LMP1 ha mostrato un effetto anti-proliferativo e anti-metastasi negli NPC che esprimono LMP1. Questi risultati hanno suggerito che LMP1 codificato da EBV potrebbe presentare un potenziale bersaglio molecolare per il trattamento dei carcinomi associati a EBV.

I DNAzimi sono oligonucleotidi di DNA sintetici a filamento singolo che possono essere progettati per legarsi alla loro sequenza complementare in un RNA messaggero bersaglio (mRNA) attraverso l'accoppiamento di basi Watson-Crick e scindere l'mRNA in corrispondenza di legami fosfodiestere predeterminati. È stato proposto un modello generale per il DNAzyme, noto come modello ''10-23''. Un DNAzyme ''10-23'' ha un dominio catalitico di 15 deossiribonucleotidi, fiancheggiato da due domini di riconoscimento del substrato da sette a nove deossiribonucleotidi su ciascun braccio. Le analisi in vitro hanno dimostrato che questo tipo di DNAzyme potrebbe scindere efficacemente il suo substrato RNA a livello purinico: giunzioni pirimidiniche in condizioni fisiologiche. Questi agenti sono stati utilizzati in numerose applicazioni in vitro e in vivo per inibire l'espressione dei loro geni bersaglio e dei geni dipendenti. La loro capacità di bloccare lo sviluppo di una vasta gamma di patologie nei modelli animali suggerisce che i DNAzimi possono essere usati come agenti terapeutici.

Per sviluppare DNAzimi mirati a EBV-LMP1 per il trattamento con NPC, abbiamo dimostrato che i DNAzimi ''10-23'' modificati con fosforotioato specificamente mirati all'mRNA di LMP1 potrebbero ridurre significativamente l'espressione di LMP1 in una cellula di carcinoma nasofaringeo (NPC) e influenzato i percorsi a valle attivati ​​da LMP1, incluso il percorso NF-κB. È stato anche dimostrato che la soppressione dell'espressione di LMP1 da parte del DNAzyme DZ1 mirato a LMP1 potrebbe migliorare la radiosensibilità sia in vivo che in vitro. La radioresistenza è stata uno degli ostacoli in ambito clinico per un'efficace terapia del cancro, che si pensa sia associata a molteplici vie di segnalazione in diversi tipi di cancro. L'ATM (ataxia telangiectasia mutated) è una protein chinasi nucleare da 350 kDa con un dominio carbossiterminale fosfatidilinositolo 3-chinasi simile alla chinasi[1]. Funziona come un membro di un sistema coordinato che rileva le rotture del DNA; arresta temporaneamente le celle ai checkpoint G1, S o G2; e attiva la riparazione del DNA. Le cellule prive di proteina ATM funzionale mostrano una maggiore sensibilità alle radiazioni ionizzanti (IR) e ad altri eventi genotossici. NF-κB (fattore nucleare kappa B) può attivare un gran numero di geni coinvolti nelle risposte allo stress, nell'infiammazione e nella morte cellulare programmata (apoptosi). Gli omodimeri P50 o gli eterodimeri p50/p65 o p50/c-Rel si legano ai siti di legame del DNA NF-κB nelle regioni del promotore di molti geni che rispondono allo stress, suggerendo un gene complesso e una rete di regolazione fisiologica controllata da NF-κB nella risposta allo stress. L'elevata attività basale di NF-κB in alcuni tumori è stata collegata alla resistenza del tumore alla chemioterapia e alle radiazioni. L'inibizione di NF-κB ha bloccato la radioresistenza adattativa. I nostri studi per il meccanismo molecolare della radiosensibilizzazione mediata da LMP1-DNAzyme hanno rivelato che LMP1 ha attivato l'espressione ATM attraverso la via NF-κB e l'inibizione dell'espressione LMP1 da parte del DNAzyme ha attenuato il legame del fattore di trascrizione NF-κB al promotore ATM. Ulteriori prove hanno mostrato che la radiosensibilità è stata recuperata quando l'espressione ATM è stata abbattuta dal siRNA negli NPC. Insieme, tutti i nostri dati supportano la nostra ipotesi e forniscono solide basi sperimentali per l'uso di DNAzimi mirati a LMP1 come potenziali radiosensibilizzatori per il trattamento dei carcinomi associati a EBV.

Studi tossicologici sui topi hanno mostrato che non è stata osservata alcuna morbilità o mortalità in nessuno dei gruppi di dosaggio durante il corso dello studio (50 mg, 100 mg e 200 mg/kg). Tutti i valori ematologici e i risultati biochimici dei test di funzionalità epatica e renale erano normali. Nessuna lesione microscopica attribuibile al trattamento con oligonucleotide DNAzyme modificato è stata trovata nel fegato, nella milza e nei reni in nessun gruppo. Dopo i.v. somministrazione di 100 mg/kg DNAzyme oligonucleotide nei topi, la concentrazione plasmatica di picco di 24,13 ± 2,6 μg/ml è stato raggiunto. La diminuzione della concentrazione plasmatica di DNAzyme ha seguito un pattern bi-esponenziale con un'emivita di distribuzione iniziale (t1/2α) di 0,18±0,03 h e un'emivita terminale (t1/2β) di 2,55±1,0 h, e l'area sotto la curva concentrazione plasmatica-tempo (AUC) era 54,17±9,1μg.h/ml.

DISEGNO DELLO STUDIO Questo studio sarà uno studio clinico di Fase I/II randomizzato, in doppio cieco e controllato con placebo. Quaranta (40) pazienti saranno randomizzati in uno dei due gruppi di uguali dimensioni: gruppo placebo che riceve soluzione salina mediante iniezione intratumorale e radioterapia standard; o gruppo DZ1 che riceve LMP1 DNAzyme (DZ1) e radioterapia standard. Il gruppo placebo fornirà la base per la valutazione della sicurezza e dell'efficacia di DZ1.

I pazienti ricevono placebo o iniezione DZ1 due (2) ore prima della radioterapia radicale il lunedì e il giovedì per sette settimane. La radioterapia radicale viene somministrata ai pazienti 5 volte a settimana con 2 Gy per ogni trattamento. L'intera procedura dura sette settimane.

Tutti i pazienti completeranno lo studio a 104 settimane dopo la prima iniezione. I pazienti saranno sottoposti a valutazione e test ogni settimana nelle prime sette settimane, poi ogni tre mesi dalle settimane 8 alla settimana 104.

Lo studio includerà valutazioni di sicurezza e tollerabilità: