Klinische studie van EBV-LMP1 gericht DNAzyme voor de behandeling van nasofarynxcarcinoom (NPC-DZ)

INLEIDING Nasofarynxcarcinoom (NPC) is wereldwijd een ernstig gezondheidsprobleem, vooral bij de Zuid-Chinese bevolking, met een incidentie van 15 tot 50 per 100.000. NPC is een epitheliale maligniteit met opvallende raciale en geografische spreidingsverschillen. Hoge incidentiecijfers worden waargenomen bij de Zuidoost-Chinese bevolking, en vergelijkbare percentages zijn gemeld bij deze mensen, waar ze ook naartoe zijn gemigreerd, inclusief Singapore, Taiwan en Hong Kong. Deze incidentie is bijna 100 keer hoger dan bij blanke populaties. Het meest unieke kenmerk van NPC is de bijna universele associatie met de infectie van het Epstein-Barr-virus (EBV), het eerste menselijke virus waarvan is vastgesteld dat het betrokken is bij de pathogenese van verschillende maligniteiten en een bijzonder nauwe associatie heeft met NPC, aangezien EBV genoom kan worden gedetecteerd in vrijwel alle NPC-cellen. Hoewel radiotherapie de eerstelijnsbehandelingen voor NPC is geweest, blijft radioresistentie een belangrijk klinisch probleem voor de NPC-radiotherapie. Er is dus een onvervulde medische behoefte om nieuwe radiosensibilisatoren voor NPC-therapie te ontdekken en te ontwikkelen.

EBV-infectie bij NPC wordt geclassificeerd als type II latente infectie waarbij alleen EBV-expressies van nucleair antigeen-1 (EBNA-1), latent membraaneiwit-1 (LMP1), LMP2 en EBV vroege RNA (EBER) kunnen worden gedetecteerd. Van deze eiwitten wordt aangenomen dat LMP1 een sleutelrol speelt in de pathogenese van NPC. Als een integraal membraaneiwit van 60 kD functioneert LMP1 als een constitutief actieve tumornecrosefactorreceptor (TNFR) en draagt ​​het bij aan meerdere aspecten van NPC door een aantal signaalroutes te activeren, waaronder nucleaire factor NF-KB, activatoreiwit-1 (AP-1 ), en Janus-kinase/signaaltransducer en activator van transcriptie (JAK/STAT). Activering van NF-kB of AP-1 door LMP1 is in verband gebracht met de opregulering van sommige cellulaire eiwitten en remming van apoptose. Afhankelijk van de celtypen is aangetoond dat de expressie van LMP1 verschillende rollen speelt als reactie op biologische en fysiologische prikkels. Het fungeert als een primair oncoproteïne voor de onsterfelijkheid van menselijke cellen en wordt ook getoond als het enige EBV-gecodeerde product dat fibroblastcellijnen van knaagdieren, menselijke epitheelcellen en keratinocyten kan transformeren.

Gezien de cruciale rol van virale oncoproteïnen bij transformatie en apoptose, zou onderdrukking van sommige virale oncoproteïnen een verstandige strategie zijn om NPC genetisch te behandelen. Er is inderdaad aangetoond dat antisense-oligonucleotiden tegen LMP1 of EBNA1 de virale oncoproteïne-expressie remmen, apoptose induceren en de EBV-positieve cellen gevoelig maken voor cytotoxische middelen. Onlangs hebben enkele experimentele onderzoeken aangetoond dat de RNA-interferentie tegen LMP1 een anti-proliferatief en anti-metastase-effect vertoonde in NPC's die LMP1 tot expressie brachten. Deze resultaten suggereerden dat door EBV gecodeerd LMP1 een potentieel moleculair doelwit kan zijn voor de behandeling van EBV-geassocieerde carcinomen.

DNAzymen zijn synthetische, enkelstrengige DNA-oligonucleotiden die kunnen worden gemanipuleerd om te binden aan hun complementaire sequentie in een doelwit-boodschapper-RNA (mRNA) door middel van Watson-Crick-basenparing en het mRNA te splitsen op vooraf bepaalde fosfodiësterkoppelingen. Er is een algemeen model voor het DNAzyme voorgesteld, dat bekend staat als het ''10-23''-model. Een ''10-23'' DNAzyme heeft een katalytisch domein van 15 deoxyribonucleotiden, geflankeerd door twee substraatherkenningsdomeinen van zeven tot negen deoxyribonucleotiden aan elke arm. In vitro-analyses toonden aan dat dit type DNAzyme zijn substraat-RNA effectief kon splitsen op purine:pyrimidine-overgangen onder fysiologische omstandigheden. Deze middelen zijn gebruikt in een aantal in vitro en in vivo toepassingen om de expressie van hun doelgenen en de afhankelijke genen te remmen. Hun vermogen om de ontwikkeling van een breed scala aan pathologieën in diermodellen te blokkeren, suggereert dat DNAzymes als therapeutische middelen kunnen worden gebruikt.

Om op EBV-LMP1 gerichte DNAzymen voor NPC-behandeling te ontwikkelen, hebben we aangetoond dat de fosforothioaat-gemodificeerde ''10-23'' DNAzymen die specifiek gericht zijn op het LMP1-mRNA, de expressie van LMP1 in een nasofarynxcarcinoomcel (NPC) aanzienlijk kunnen verlagen en beïnvloedde de stroomafwaartse routes geactiveerd door LMP1, inclusief de NF-KB-route. Er werd ook aangetoond dat onderdrukking van de LMP1-expressie door het op LMP1 gerichte DNAzyme DZ1 de radiosensitiviteit zowel in vivo als in vitro zou kunnen verbeteren. Radioresistentie is een van de belemmeringen geweest in klinische settings voor effectieve kankertherapie, waarvan wordt gedacht dat het verband houdt met meerdere signaalroutes bij verschillende soorten kanker. ATM (ataxie telangiectasia gemuteerd) is een nucleair eiwitkinase van 350 kDa met een carboxylterminaal fosfatidylinositol 3-kinase-achtig kinasedomein[1]. Het functioneert als een lid van een gecoördineerd systeem dat DNA-breuken detecteert; arresteert de cellen tijdelijk bij G1-, S- of G2-controlepunten; en activeert DNA-herstel. Cellen zonder functioneel ATM-eiwit vertonen een verhoogde gevoeligheid voor ioniserende straling (IR) en andere genotoxische gebeurtenissen. NF-KB (nucleaire factor kappa B) kan een groot aantal genen activeren die betrokken zijn bij stressreacties, ontstekingen en geprogrammeerde celdood (apoptose). P50-homodimeren of p50/p65- of p50/c-Rel-heterodimeren binden aan de NF-KB-DNA-bindingsplaatsen in de promoterregio's van veel op stress reagerende genen, wat een complex gen- en fysiologisch regulatienetwerk suggereert dat wordt gecontroleerd door NF-KB bij stressrespons. De verhoogde basale NF-KB-activiteit bij bepaalde kankers is in verband gebracht met tumorresistentie tegen chemotherapie en bestraling. Remming van NF-KB blokkeerde de adaptieve radioresistentie. Onze studies voor het moleculaire mechanisme van de door LMP1-DNAzyme gemedieerde radiosensibilisatie onthulden dat LMP1 de ATM-expressie activeerde via de NF-KB-route en dat remming van LMP1-expressie door het DNAzyme de binding van NF-KB-transcriptiefactor aan de ATM-promoter verzwakte. Verder bewijs toonde aan dat de radiogevoeligheid werd hersteld toen de ATM-expressie werd afgebroken door siRNA in NPC's. Samen ondersteunen al onze gegevens onze hypothese en bieden ze een solide experimentele basis voor het gebruik van LMP1-gerichte DNAzymes als potentiële radiosensibilisatoren voor de behandeling van de EBV-geassocieerde carcinomen.

Toxicologische studies bij muizen toonden aan dat er geen morbiditeit of mortaliteit werd waargenomen in een van de doseringsgroepen tijdens de studie (50 mg, 100 mg en 200 mg/kg). Alle hematologische waarden en biochemische resultaten van lever- en nierfunctietesten waren normaal. Er werd in geen enkele groep een microscopische laesie gevonden die kon worden toegeschreven aan de gemodificeerde behandeling met DNAzyme-oligonucleotide in lever, milt en nier. Na i.v. toediening van 100 mg / kg DNAzyme-oligonucleotide bij muizen, de piekplasmaconcentratie van 24,13 ± 2,6 μg / ml is behaald. De daling van de plasmaconcentratie van DNAzyme volgde een bi-exponentieel patroon met initiële distributiehalfwaardetijd (t1/2α) van 0,18 ± 0,03 h en een terminale halfwaardetijd (t1/2β) van 2,55 ± 1,0 uur, en de oppervlakte onder de plasmaconcentratie-tijdcurve (AUC) was 54,17 ± 9,1 μg.u/ml.

STUDIEOPZET Deze studie zal een gerandomiseerde, dubbelblinde en placebogecontroleerde fase I/II klinische studie zijn. Veertig (40) patiënten zullen worden gerandomiseerd naar een van twee groepen van gelijke grootte: placebogroep die zoutoplossing krijgt via intratumorinjectie en standaard radiotherapie; of DZ1-groep die LMP1 DNAzyme (DZ1) en standaard radiotherapie krijgt. De placebogroep zal de basis vormen voor de beoordeling van de veiligheid en werkzaamheid van DZ1.

Patiënten krijgen een placebo- of DZ1-injectie twee (2) uur voorafgaand aan radicale bestralingstherapie op maandag en donderdag gedurende zeven weken. De radicale radiotherapie wordt 5 keer per week aan patiënten gegeven met 2 Gy van elke behandeling. De hele procedure duurt zeven weken.

Alle patiënten zullen het onderzoek 104 weken na de eerste injectie voltooien. De patiënten worden de eerste zeven weken elke week beoordeeld en getest, daarna elke drie maanden van week 8 tot week 104.

De studie omvat evaluaties van veiligheid en verdraagbaarheid: