Estudo Clínico da DNAzima Direcionada EBV-LMP1 para Tratar Carcinoma Nasofaríngeo (NPC-DZ)

INTRODUÇÃO O carcinoma de nasofaringe (NPC) é um grave problema de saúde em todo o mundo, particularmente na população do sul da China, com uma taxa de incidência variando de 15 a 50 por 100.000. NPC é uma malignidade epitelial com diferenças marcantes de distribuição racial e geográfica. Altas taxas de incidência são observadas na população do sudeste da China, e taxas semelhantes foram relatadas nessas pessoas onde quer que tenham migrado, incluindo Cingapura, Taiwan e Hong Kong. Essa incidência é quase 100 vezes maior do que nas populações brancas. A característica mais singular do NPC é sua associação quase universal com a infecção do vírus Epstein-Barr (EBV), que é o primeiro vírus humano identificado como envolvido na patogênese de várias malignidades e tem uma associação particularmente próxima com o NPC, como EBV genoma pode ser detectado em praticamente todas as células NPC. Embora a radioterapia tenha sido o tratamento de primeira linha para o NPC, a radiorresistência continua sendo um problema clínico significativo para a radioterapia do NPC. Assim, há necessidades médicas não atendidas para descobrir e desenvolver novos radiossensibilizadores para a terapia NPC.

A infecção por EBV em NPC é classificada como infecção latente tipo II, na qual apenas as expressões de antígeno nuclear 1 de EBV (EBNA-1), proteína de membrana latente 1 (LMP1), LMP2 e RNA inicial de EBV (EBER) podem ser detectadas. Entre essas proteínas, acredita-se que a LMP1 desempenhe um papel fundamental na patogênese do NPC. Como uma proteína de membrana integral de 60kD, LMP1 funciona como um receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) constitutivamente ativo e contribui para vários aspectos do NPC por meio da ativação de várias vias de sinalização, incluindo fator nuclear NF-κB, proteína ativadora-1 (AP-1 ) e Janus quinase/transdutor de sinal e ativador da transcrição (JAK/STAT). A ativação de NF-kB ou AP-1 por LMP1 tem sido associada à regulação positiva de algumas proteínas celulares e inibição da apoptose. Dependendo dos tipos de células, a expressão de LMP1 demonstrou desempenhar papéis diferentes em resposta a estímulos biológicos e fisiológicos. Ele atua como uma oncoproteína primária para a imortalização de células humanas e também é mostrado como o único produto codificado por EBV que pode transformar a linha celular de fibroblastos de roedores, células epiteliais humanas e queratinócitos.

Dado o papel crítico das oncoproteínas virais na transformação e apoptose, a supressão de algumas oncoproteínas virais forneceria uma estratégia sensata para tratar geneticamente o NPC. De fato, oligonucleotídeos antisense contra LMP1 ou EBNA1 demonstraram inibir a expressão de oncoproteínas virais, induzir apoptose e sensibilizar as células EBV-positivas a agentes citotóxicos. Recentemente, alguns estudos experimentais indicaram que a interferência do RNA contra LMP1 exibiu um efeito antiproliferativo e antimetástase em NPCs que expressam LMP1. Esses resultados sugerem que o LMP1 codificado por EBV pode apresentar um potencial alvo molecular para o tratamento de carcinomas associados a EBV.

As DNAzimas são oligonucleotídeos sintéticos de DNA de fita simples que podem ser manipulados para se ligarem à sua sequência complementar em um RNA mensageiro alvo (mRNA) por meio do emparelhamento de bases Watson-Crick e clivar o mRNA em ligações fosfodiéster predeterminadas. Foi proposto um modelo geral para a DNAzima, conhecido como modelo ''10-23''. Uma DNAzima ''10-23'' tem um domínio catalítico de 15 desoxirribonucleotídeos, flanqueado por dois domínios de reconhecimento de substrato de sete a nove desoxirribonucleotídeos em cada braço. Análises in vitro mostraram que esse tipo de DNAzima poderia efetivamente clivar seu substrato de RNA nas junções purina: pirimidina sob condições fisiológicas. Esses agentes têm sido usados ​​em diversas aplicações in vitro e in vivo para inibir a expressão de seus genes alvo e dos genes dependentes. Sua capacidade de bloquear o desenvolvimento de diversas patologias em modelos animais sugere que as DNAzimas podem ser usadas como agentes terapêuticos.

Para desenvolver DNAzimas direcionadas a EBV-LMP1 para tratamento de NPC, mostramos que as DNAzimas ''10-23'' modificadas por fosforotioato especificamente direcionadas ao mRNA de LMP1 poderiam significativamente diminuir a expressão de LMP1 em uma célula de carcinoma nasofaríngeo (NPC) e afetou as vias downstream ativadas por LMP1, incluindo a via NF-κB. Também foi demonstrado que a supressão da expressão de LMP1 pela DNAzima DZ1 direcionada a LMP1 poderia aumentar a radiossensibilidade in vivo e vitro. A radiorresistência tem sido um dos impedimentos em ambientes clínicos para uma terapia eficaz contra o câncer, que se acredita estar associada a múltiplas vias de sinalização em diferentes tipos de câncer. ATM (ataxia telangiectasia mutated) é uma proteína quinase nuclear de 350 kDa com um domínio quinase semelhante a fosfatidilinositol 3-quinase carboxilterminal [1]. Ele funciona como membro de um sistema coordenado que detecta quebras de DNA; detém as células temporariamente nos pontos de verificação G1, S ou G2; e ativa o reparo do DNA. Células sem proteína ATM funcional apresentam maior sensibilidade à radiação ionizante (IR) e outros eventos genotóxicos. O NF-κB (fator nuclear kappa B) pode ativar um grande número de genes envolvidos em respostas ao estresse, inflamação e morte celular programada (apoptose). Os homodímeros P50 ou os heterodímeros p50/p65 ou p50/c-Rel se ligam aos sítios de ligação do DNA do NF-κB nas regiões promotoras de muitos genes responsivos ao estresse, sugerindo um gene complexo e uma rede de regulação fisiológica controlada pelo NF-κB na resposta ao estresse. A atividade basal elevada de NF-κB em certos tipos de câncer tem sido associada à resistência do tumor à quimioterapia e à radiação. A inibição do NF-κB bloqueou a radiorresistência adaptativa. Nossos estudos para o mecanismo molecular da radiossensibilização mediada por LMP1-DNAzyme revelaram que LMP1 ativou a expressão de ATM através da via NF-κB e a inibição da expressão de LMP1 pela DNAzyme atenuou a ligação do fator de transcrição NF-κB ao promotor ATM. Outras evidências mostraram que a radiossensibilidade foi recuperada quando a expressão de ATM foi derrubada por siRNA em NPCs. Juntos, todos os nossos dados apóiam nossa hipótese e fornecem uma base experimental sólida para o uso de DNAzimas direcionadas a LMP1 como potenciais radiossensibilizadores para o tratamento de carcinomas associados ao EBV.

Estudos toxicológicos em camundongos mostraram que nenhuma morbidade ou mortalidade foi observada em nenhum dos grupos de dosagem durante o estudo (50 mg, 100 mg e 200 mg/kg). Todos os valores hematológicos e resultados bioquímicos dos testes de função hepática e renal eram normais. Nenhuma lesão microscópica que pudesse ser atribuída ao tratamento com oligonucleotídeo DNAzyme modificado foi encontrada no fígado, baço e rim em qualquer grupo. Depois de i.v. administração de 100 mg/kg DNAzyme oligonucleotide em camundongos, a concentração plasmática máxima de 24,13±2,6μg/ml foi alcançado. A diminuição da concentração plasmática de DNAzyme seguiu um padrão bi-exponencial com meia-vida de distribuição inicial (t1/2α) de 0,18±0,03 h e meia-vida terminal (t1/2β) de 2,55±1,0 h, e a área sob a curva de concentração plasmática-tempo (AUC) foi de 54,17±9,1μg.h/ml.

DESENHO DO ESTUDO Este estudo será um ensaio clínico de Fase I/II randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. Quarenta (40) pacientes serão randomizados para um dos dois grupos de tamanho igual: grupo placebo recebendo solução salina por injeção intratumoral e radioterapia padrão; ou grupo DZ1 recebendo LMP1 DNAzyme (DZ1) e radioterapia padrão. O grupo placebo fornecerá a base para avaliação da segurança e eficácia do DZ1.

Os pacientes recebem injeção de placebo ou DZ1 duas (2) horas antes da radioterapia radical na segunda e quinta-feira durante sete semanas. A radioterapia radical é administrada aos pacientes 5 vezes por semana com 2 Gy de cada tratamento. Todo o procedimento dura sete semanas.

Todos os pacientes completarão o estudo em 104 semanas após a primeira injeção. Os pacientes serão submetidos a avaliações e testes todas as semanas nas primeiras sete semanas, depois a cada três meses, da semana 8 à semana 104.

O estudo incluirá avaliações de segurança e tolerabilidade: