Az EBV-LMP1 célzott DNS-enzim klinikai vizsgálata orrgarat karcinóma kezelésére (NPC-DZ)

BEVEZETÉS A nasopharyngealis karcinóma (NPC) súlyos egészségügyi probléma világszerte, különösen a dél-kínai lakosság körében, előfordulási aránya 15-50/100 000. Az NPC egy epiteliális rosszindulatú daganat, feltűnő faji és földrajzi eloszlási különbségekkel. Magas előfordulási arányt figyeltek meg a délkelet-kínai lakosság körében, és hasonló arányt jelentettek ezeknél az embereknél, bárhová is vándoroltak, beleértve Szingapúrt, Tajvant és Hongkongot. Ez az incidencia csaknem 100-szor magasabb, mint a fehér populációkban. Az NPC legkülönlegesebb tulajdonsága, hogy szinte egyetemes kapcsolatban áll az Epstein-Barr vírus (EBV) fertőzésével, amely az első olyan humán vírus, amelyet azonosítottak számos rosszindulatú daganat patogenezisében, és különösen szoros kapcsolatban áll az NPC-vel, mint az EBV-vel. A genom gyakorlatilag minden NPC sejtben kimutatható. Míg a sugárterápia az NPC első vonalbeli kezelési módja, a sugárrezisztencia továbbra is jelentős klinikai probléma az NPC sugárterápia során. Így kielégítetlen orvosi igények merülnek fel az NPC-terápia új sugárérzékenyítő szerek felfedezésére és kifejlesztésére.

Az NPC-ben az EBV fertőzés a II. típusú látens fertőzésnek minősül, amelyben csak az EBV nukleáris antigén-1 (EBNA-1), látens membránfehérje-1 (LMP1), LMP2 és EBV korai RNS (EBER) expressziója mutatható ki. Ezen fehérjék közül az LMP1 kulcsszerepet játszik az NPC patogenezisében. 60 kD-os integrált membránfehérjeként az LMP1 konstitutívan aktív tumor nekrózis faktor receptorként (TNFR) működik, és számos jelátviteli útvonal aktiválásával hozzájárul az NPC számos aspektusához, beleértve az NF-κB nukleáris faktort és az aktivátor protein-1-et (AP-1). ), valamint a Janus kináz/jelátalakító és a transzkripció aktivátora (JAK/STAT). Az NF-kB vagy AP-1 LMP1 általi aktiválása összefüggésbe hozható egyes sejtfehérjék felszabályozásával és az apoptózis gátlásával. A sejttípusoktól függően az LMP1 expressziója különböző szerepet játszik a biológiai és fiziológiai ingerekre adott válaszként. Elsődleges onkoproteinként működik az emberi sejtek halhatatlanná tételében, és az egyetlen olyan EBV-kódolt termék, amely képes átalakítani a rágcsáló fibroblaszt sejtvonalat, az emberi hámsejteket és a keratinocitákat.

Tekintettel a vírus onkoproteineknek a transzformációban és az apoptózisban betöltött kritikus szerepére, néhány vírus onkoproteinek elnyomása ésszerű stratégiát jelentene az NPC genetikai kezelésére. Valójában az LMP1 vagy EBNA1 elleni antiszensz oligonukleotidokról kimutatták, hogy gátolják a vírus onkoprotein expresszióját, apoptózist indukálnak, és érzékenyebbé teszik az EBV-pozitív sejteket a citotoxikus ágensekkel szemben. A közelmúltban néhány kísérleti tanulmány azt mutatta, hogy az LMP1 elleni RNS-interferencia antiproliferatív és metasztázis-ellenes hatást mutatott az LMP1-et expresszáló NPC-kben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az EBV-kódolt LMP1 potenciális molekuláris célpont lehet az EBV-vel összefüggő karcinómák kezelésében.

A DNS-enzimek szintetikus, egyszálú DNS-oligonukleotidok, amelyek úgy módosíthatók, hogy Watson-Crick bázispárosodás révén kötődjenek a komplementer szekvenciájukhoz a célhírvivő RNS-ben (mRNS), és előre meghatározott foszfodiészter kötéseknél hasítsák az mRNS-t. Javasoltak egy általános modellt a DNAzyme számára, ez a „10-23” modell. A „10-23” DNS-enzim 15 dezoxiribonukleotidból álló katalitikus domént tartalmaz, amelyet két, hét-kilenc dezoxiribonukleotidból álló szubsztrát-felismerő domén szegélyez mindkét karnál. Az in vitro analízisek kimutatták, hogy az ilyen típusú DNS-enzimek fiziológiás körülmények között hatékonyan hasítják szubsztrát RNS-ét a purin:pirimidin kapcsolatoknál. Ezeket a szereket számos in vitro és in vivo alkalmazásban alkalmazták célgénjeik és a függő gének expressziójának gátlására. Az a képességük, hogy blokkolják a különféle patológiák kialakulását állatmodellekben, arra utal, hogy a DNS-enzimek terápiás szerekként használhatók.

Az EBV-LMP1 célzott DNS-enzimek NPC kezelésére való kifejlesztéséhez kimutattuk, hogy a foszforotioáttal módosított "10-23" DNS-enzimek, amelyek kifejezetten az LMP1 mRNS-re irányulnak, jelentősen csökkenthetik az LMP1 expresszióját orrgarat karcinóma sejtben (NPC) és befolyásolta az LMP1 által aktivált downstream útvonalakat, beleértve az NF-κB útvonalat is. Azt is kimutatták, hogy az LMP1 expressziójának elnyomása az LMP1-re célzott DNAzyme DZ1 által fokozhatja a sugárérzékenységet mind in vivo, mind vitro. A sugárrezisztencia az egyik akadálya a hatékony rákterápia klinikai környezetében, amelyről úgy gondolják, hogy többféle jelátviteli útvonalhoz kapcsolódik a különböző ráktípusokban. Az ATM (ataxia telangiectasia mutált) egy nukleáris 350 kDa-os protein kináz karboxilterminális foszfatidil-inozitol 3-kináz-szerű kináz doménnel[1]. Egy koordinált rendszer tagjaként működik, amely észleli a DNS-töréseket; ideiglenesen letartóztatja a cellákat a G1, S vagy G2 ellenőrzőpontokon; és aktiválja a DNS-javítást. A funkcionális ATM-fehérjét nem tartalmazó sejtek fokozott érzékenységet mutatnak az ionizáló sugárzásra (IR) és más genotoxikus eseményekre. Az NF-κB (nukleáris kappa B faktor) számos gént képes aktiválni, amelyek részt vesznek a stresszválaszokban, a gyulladásban és a programozott sejthalálban (apoptózisban). A P50 homodimerek vagy p50/p65 vagy p50/c-Rel heterodimerek számos stresszre reagáló gén promoter régiójában kötődnek az NF-κB DNS kötőhelyeihez, ami arra utal, hogy a stresszválasz során az NF-κB által irányított komplex gén és fiziológiai szabályozási hálózat alakul ki. Bizonyos rákos megbetegedések esetén az NF-κB megnövekedett alapaktivitása összefüggésbe hozható a daganat kemoterápiával és sugárzással szembeni rezisztenciájával. Az NF-κB gátlása blokkolta az adaptív radiorezisztenciát. Az LMP1-DNAzyme által közvetített radioszenzitizáció molekuláris mechanizmusára vonatkozó vizsgálataink kimutatták, hogy az LMP1 az NF-κB útvonalon keresztül aktiválta az ATM expressziót, és az LMP1 expressziójának a DNAzyme általi gátlása gyengítette az NF-κB transzkripciós faktor kötődését az ATM promoterhez. További bizonyítékok azt mutatták, hogy a sugárérzékenység helyreállt, amikor az ATM-expressziót az siRNS leütötte az NPC-kben. Összességében minden adatunk alátámasztja hipotézisünket, és szilárd kísérleti alapot biztosít az LMP1-célzott DNS-enzimek potenciális sugárérzékenyítőként történő alkalmazásához az EBV-vel összefüggő karcinómák kezelésében.

Egereken végzett toxikológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a vizsgálat során (50 mg, 100 mg és 200 mg/kg) egyik adagolási csoportban sem figyeltek meg morbiditást vagy mortalitást. A máj- és vesefunkciós tesztekből származó összes hematológiai érték és biokémiai eredmény normális volt. Májban, lépben és vesében egyetlen csoportban sem találtunk olyan mikroszkopikus léziót, amely a módosított DNAzyme oligonukleotid kezelésnek tulajdonítható lenne. Miután i.v. 100 mg/kg DNAzyme oligonukleotid egerekben történő beadása, a plazma csúcskoncentráció 24,13±2,6 μg/ml el lett érve. A DNAzyme plazmakoncentrációjának csökkenése bi-exponenciális mintát követett, a kezdeti megoszlási felezési idő (t1/2α) 0,18±0,03 volt. h és terminális felezési ideje (t1/2β) 2,55±1,0 h, a plazmakoncentráció-idő görbe alatti terület (AUC) pedig 54,17±9,1 μg.h/ml volt.

A VIZSGÁLAT TERVEZÉSE Ez a vizsgálat egy randomizált, kettős-vak és placebo-kontrollos I/II. fázisú klinikai vizsgálat. Negyven (40) beteget véletlenszerűen besorolnak a két azonos méretű csoport egyikébe: placebo csoport, amely fiziológiás sóoldatot kap tumoron belüli injekcióban és standard sugárkezelés; vagy DZ1 csoport, amely LMP1 DNAzyme-t (DZ1) és standard sugárterápiát kap. A placebo csoport képezi az alapot a DZ1 biztonságosságának és hatékonyságának értékeléséhez.

A betegek hét héten át, hétfőn és csütörtökön két (2) órával a radikális sugárterápia előtt placebót vagy DZ1 injekciót kapnak. A radikális sugárkezelést hetente 5 alkalommal adják a betegeknek, minden kezelésből 2 Gy. Az egész eljárás hét hétig tart.

Minden beteg befejezi a vizsgálatot az első injekció beadása után 104 héttel. A betegeket az első hét hétben hetente, majd a 8. héttől a 104. hétig háromhavonta értékelik és tesztelik.

A tanulmány a biztonságosság és az elviselhetőség értékelését tartalmazza: