EBV-LMP1靶向DNA酶治疗鼻咽癌的临床研究 (NPC-DZ)

引言 鼻咽癌 (NPC) 是世界范围内严重的健康问题，特别是在中国南方人群中，发病率为每 10 万人 15 至 50 例。 NPC 是一种上皮性恶性肿瘤，具有显着的种族和地理分布差异。 在中国东南部人群中观察到高发病率，并且在这些人迁移到任何地方（包括新加坡、台湾和香港）时都报告了相似的发病率。 这一发病率几乎是白人人群的 100 倍。 NPC 最独特的特征是它与爱泼斯坦-巴尔病毒 (EBV) 的感染几乎普遍相关，EBV 是第一种被鉴定为参与多种恶性肿瘤发病机制的人类病毒，并且与 NPC 有着特别密切的关联，如 EBV基因组几乎可以在所有 NPC 细胞中检测到。 虽然放射治疗一直是鼻咽癌的一线治疗方法，但放射抵抗仍然是鼻咽癌放疗的一个重要临床问题。 因此，发现和开发用于 NPC 治疗的新型放射增敏剂的医学需求尚未得到满足。

鼻咽癌EBV感染属于Ⅱ型潜伏感染，仅检测到EBV核抗原1（EBNA-1）、潜伏膜蛋白1（LMP1）、LMP2和EBV早期RNA（EBER）表达。 在这些蛋白质中，LMP1 被认为在 NPC 的发病机制中起关键作用。 作为一种 60kD 的整合膜蛋白，LMP1 作为组成型活性肿瘤坏死因子受体 (TNFR) 发挥作用，并通过激活包括核因子 NF-κB、激活蛋白-1(AP-1) 在内的多种信号通路促进 NPC 的多个方面), 和 Janus 激酶/信号转导和转录激活因子 (JAK/STAT)。 LMP1 对 NF-kB 或 AP-1 的激活与一些细胞蛋白的上调和细胞凋亡的抑制有关。 根据细胞类型的不同，LMP1 的表达已被证明在响应生物和生理刺激方面发挥不同的作用。 它作为人类细胞永生化的主要癌蛋白，也是唯一可以转化啮齿动物成纤维细胞系、人类上皮细胞和角质形成细胞的 EBV 编码产物。

鉴于病毒癌蛋白在转化和细胞凋亡中的关键作用，抑制某些病毒癌蛋白将为 NPC 的基因治疗提供明智的策略。 事实上，针对 LMP1 或 EBNA1 的反义寡核苷酸已被证明可抑制病毒癌蛋白表达，诱导细胞凋亡，并使 EBV 阳性细胞对细胞毒剂敏感。 最近，一些实验研究表明，针对 LMP1 的 RNA 干扰在表达 LMP1 的 NPC 中表现出抗增殖和抗转移作用。 这些结果表明 EBV 编码的 LMP1 可能是治疗 EBV 相关癌的潜在分子靶标。

DNAzymes 是合成的单链 DNA 寡核苷酸，可以通过 Watson-Crick 碱基配对将其设计为与目标信使 RNA (mRNA) 中的互补序列结合，并在预定的磷酸二酯连接处切割 mRNA。 已经提出了 DNAzyme 的通用模型，称为“10-23”模型。 “10-23”DNAzyme 有一个由 15 个脱氧核糖核苷酸组成的催化结构域，两侧是两个底物识别结构域，每条臂上有 7 到 9 个脱氧核糖核苷酸。 体外分析表明，这种类型的 DNAzyme 可以在生理条件下有效地在嘌呤：嘧啶连接处切割其底物 RNA。 这些试剂已用于多种体外和体内应用，以抑制其靶基因和依赖基因的表达。 它们在动物模型中阻止各种病理发展的能力表明 DNAzymes 可以用作治疗剂。

为了开发用于 NPC 治疗的 EBV-LMP1 靶向 DNAzyme，我们发现专门针对 LMP1 mRNA 的硫代磷酸酯修饰的“10-23”DNAzyme 可以显着下调鼻咽癌细胞 (NPC) 中 LMP1 的表达，并且影响由 LMP1 激活的下游通路，包括 NF-κB 通路。 还证明了 LMP1 靶向 DNAzyme DZ1 对 LMP1 表达的抑制可以增强体内和体外的放射敏感性。 放射抗性一直是临床环境中有效癌症治疗的障碍之一，这被认为与不同癌症类型的多种信号通路有关。 ATM（共济失调性毛细血管扩张症突变）是一种核蛋白激酶，大小为 350 kDa，具有羧基末端磷脂酰肌醇 3-激酶样激酶结构域 [1]。 它作为检测 DNA 断裂的协调系统的成员发挥作用；在 G1、S 或 G2 检查点临时逮捕细胞；并激活 DNA 修复。 缺乏功能性 ATM 蛋白的细胞对电离辐射 (IR) 和其他遗传毒性事件的敏感性增加。 NF-κB（核因子 kappa B）可以激活大量与应激反应、炎症和程序性细胞死亡（细胞凋亡）有关的基因。 P50 同二聚体或 p50/p65 或 p50/c-Rel 异二聚体与许多应激反应基因启动子区域的 NF-κB DNA 结合位点结合，表明在应激反应中由 NF-κB 控制的复杂基因和生理调节网络。 某些癌症中升高的基础 NF-κB 活性与肿瘤对化疗和放疗的耐药性有关。 抑制 NF-κB 可阻断适应性放射抗性。 我们对 LMP1-DNAzyme 介导的放射增敏作用的分子机制的研究表明，LMP1 通过 NF-κB 途径激活 ATM 表达，DNAzyme 对 LMP1 表达的抑制减弱了 NF-κB 转录因子与 ATM 启动子的结合。 进一步的证据表明，当 NPC 中的 ATM 表达被 siRNA 敲低时，放射敏感性恢复。 总之，我们所有的数据都支持我们的假设，并为使用 LMP1 靶向脱氧核酶作为潜在放射增敏剂治疗 EBV 相关癌提供了坚实的实验基础。

小鼠毒理学研究表明，在研究过程中（50mg、100mg 和 200mg/kg），在任何给药组中均未观察到发病率或死亡率。 肝肾功能检查的所有血液学值和生化结果均正常。 在任何组的肝脏、脾脏和肾脏中均未发现可归因于经修饰的脱氧核酶寡核苷酸处理的微观损伤。 静脉注射后 小鼠给予100 mg/kg DNAzyme oligonucleotide，血药峰浓度为24.13±2.6μg/ml 已实现。 DNAzyme 血浆浓度的降低遵循双指数模式，初始分布半衰期 (t1/2α) 为 0.18±0.03 h 和终末半衰期 (t1/2β) 为 2.55±1.0 h，血药浓度-时间曲线下面积（AUC）为54.17±9.1μg.h/ml。

研究设计 本研究将是一项随机、双盲和安慰剂对照的 I/II 期临床试验。 四十 (40) 名患者将被随机分配到人数相等的两组中的一组：安慰剂组通过肿瘤内注射和标准放疗接受生理盐水；或 DZ1 组接受 LMP1 DNAzyme (DZ1) 和标准放疗。 安慰剂组将为评估DZ1的安全性和有效性提供依据。

在七周内的周一和周四，患者在根治性放射治疗前两 (2) 小时接受安慰剂或 DZ1 注射。 根治性放疗每周5次，每次2Gy。 整个过程持续七周。

所有患者将在第一次注射后 104 周完成研究。 患者将在前七周每周接受评估和测试，然后从第 8 周到第 104 周每三个月接受一次评估和测试。

该研究将包括安全性和耐受性的评估：