Klinische Studie mit EBV-LMP1-gerichtetem DNAzym zur Behandlung von Nasopharynxkarzinom (NPC-DZ)

EINFÜHRUNG Das Nasopharynxkarzinom (NPC) ist weltweit ein ernsthaftes Gesundheitsproblem, insbesondere in der südchinesischen Bevölkerung, mit einer Inzidenzrate von 15 bis 50 pro 100.000. NPC ist eine epitheliale Malignität mit auffälligen rassischen und geografischen Verteilungsunterschieden. Hohe Inzidenzraten werden in der südostchinesischen Bevölkerung beobachtet, und ähnliche Raten wurden bei diesen Menschen überall dort gemeldet, wo sie ausgewandert sind, einschließlich Singapur, Taiwan und Hongkong. Diese Inzidenz ist fast 100-mal höher als in weißen Bevölkerungsgruppen. Das einzigartigste Merkmal von NPC ist seine fast universelle Assoziation mit der Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV), dem ersten humanen Virus, von dem festgestellt wurde, dass es an der Pathogenese mehrerer Malignome beteiligt ist, und das eine besonders enge Verbindung mit NPC hat, da EBV Genom kann in praktisch allen NPC-Zellen nachgewiesen werden. Während die Strahlentherapie die Erstlinienbehandlung für NPC war, bleibt die Strahlenresistenz ein bedeutendes klinisches Problem für die NPC-Strahlentherapie. Daher besteht ein unerfüllter medizinischer Bedarf an der Entdeckung und Entwicklung neuartiger Radiosensibilisatoren für die NPC-Therapie.

Die EBV-Infektion bei NPC wird als latente Typ-II-Infektion klassifiziert, bei der nur EBV-Kernantigen-1 (EBNA-1), latentes Membranprotein-1 (LMP1), LMP2 und frühe EBV-RNA (EBER)-Expressionen nachgewiesen werden können. Unter diesen Proteinen spielt LMP1 vermutlich eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von NPC. Als integrales Membranprotein von 60 kD fungiert LMP1 als konstitutiv aktiver Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor (TNFR) und trägt zu mehreren Aspekten von NPC bei, indem es eine Reihe von Signalwegen aktiviert, darunter Nuklearfaktor NF-κB, Aktivatorprotein-1 (AP-1 ) und Januskinase/Signalwandler und Aktivator der Transkription (JAK/STAT). Die Aktivierung von NF-kB oder AP-1 durch LMP1 wurde mit der Hochregulierung einiger zellulärer Proteine ​​und der Hemmung der Apoptose in Verbindung gebracht. Je nach Zelltyp spielt die Expression von LMP1 nachweislich unterschiedliche Rollen als Reaktion auf biologische und physiologische Stimuli. Es wirkt als primäres Onkoprotein für die Immortalisierung menschlicher Zellen und ist außerdem das einzige EBV-kodierte Produkt, das Nager-Fibroblasten-Zelllinien, menschliche Epithelzellen und Keratinozyten transformieren kann.

Angesichts der entscheidenden Rolle viraler Onkoproteine ​​bei Transformation und Apoptose würde die Unterdrückung einiger viraler Onkoproteine ​​eine vernünftige Strategie zur genetischen Behandlung von NPC darstellen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass Antisense-Oligonukleotide gegen LMP1 oder EBNA1 die virale Onkoproteinexpression hemmen, Apoptose induzieren und die EBV-positiven Zellen gegenüber zytotoxischen Mitteln sensibilisieren. Kürzlich deuteten einige experimentelle Studien darauf hin, dass die RNA-Interferenz gegen LMP1 eine antiproliferative und antimetastasierende Wirkung in LMP1-exprimierenden NPCs zeigte. Diese Ergebnisse legten nahe, dass EBV-codiertes LMP1 ein potenzielles molekulares Ziel für die Behandlung von EBV-assoziierten Karzinomen darstellen könnte.

DNAzyme sind synthetische, einzelsträngige DNA-Oligonukleotide, die manipuliert werden können, um an ihre komplementäre Sequenz in einer Ziel-Messenger-RNA (mRNA) durch Watson-Crick-Basenpaarung zu binden und die mRNA an vorbestimmten Phosphodiesterbindungen zu spalten. Ein allgemeines Modell für das DNAzyme wurde vorgeschlagen und ist als das „10-23“-Modell bekannt. Ein „10-23“-DNAzym hat eine katalytische Domäne von 15 Desoxyribonukleotiden, flankiert von zwei Substraterkennungsdomänen von sieben bis neun Desoxyribonukleotiden an jedem Arm. In-vitro-Analysen zeigten, dass diese Art von DNAzym seine Substrat-RNA unter physiologischen Bedingungen an Purin:Pyrimidin-Verbindungen effektiv spalten konnte. Diese Mittel wurden in einer Reihe von In-vitro- und In-vivo-Anwendungen verwendet, um die Expression ihrer Zielgene und der abhängigen Gene zu hemmen. Ihre Fähigkeit, die Entwicklung einer Vielzahl von Pathologien in Tiermodellen zu blockieren, legt nahe, dass DNAzyme als Therapeutika verwendet werden können.

Um auf EBV-LMP1 gerichtete DNAzyme für die NPC-Behandlung zu entwickeln, zeigten wir, dass die Phosphorothioat-modifizierten „10-23“-DNAzyme, die speziell auf die LMP1-mRNA abzielen, die Expression von LMP1 in einer Nasopharynxkarzinomzelle (NPC) signifikant herunterregulieren konnten und beeinflusste die durch LMP1 aktivierten Downstream-Signalwege, einschließlich des NF-κB-Signalwegs. Es wurde auch gezeigt, dass die Unterdrückung der LMP1-Expression durch das auf LMP1 gerichtete DNAzym DZ1 die Strahlenempfindlichkeit sowohl in vivo als auch in vitro erhöhen könnte. Radioresistenz war eines der Hindernisse im klinischen Umfeld für eine wirksame Krebstherapie, von der angenommen wird, dass sie mit mehreren Signalwegen bei verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht wird. ATM (Ataxia telangiectasia mutated) ist eine nukleäre 350-kDa-Proteinkinase mit einer carboxylterminalen Phosphatidylinositol-3-kinaseähnlichen Kinasedomäne[1]. Es fungiert als Mitglied eines koordinierten Systems, das DNA-Brüche erkennt; hält die Zellen vorübergehend an den Checkpoints G1, S oder G2 fest; und aktiviert die DNA-Reparatur. Zellen, denen funktionelles ATM-Protein fehlt, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und anderen genotoxischen Ereignissen. NF-κB (Nuclear Factor Kappa B) kann eine große Anzahl von Genen aktivieren, die an Stressreaktionen, Entzündungen und dem programmierten Zelltod (Apoptose) beteiligt sind. P50-Homodimere oder p50/p65- oder p50/c-Rel-Heterodimere binden an die NF-κB-DNA-Bindungsstellen in den Promotorregionen vieler auf Stress ansprechender Gene, was auf ein komplexes Gen- und physiologisches Regulationsnetzwerk hindeutet, das von NF-κB bei der Stressreaktion kontrolliert wird. Die erhöhte basale NF-κB-Aktivität bei bestimmten Krebsarten wurde mit der Tumorresistenz gegenüber Chemotherapie und Bestrahlung in Verbindung gebracht. Die Hemmung von NF-κB blockierte die adaptive Radioresistenz. Unsere Studien zum molekularen Mechanismus der LMP1-DNAzym-vermittelten Radiosensibilisierung ergaben, dass LMP1 die ATM-Expression über den NF-κB-Weg aktivierte und die Hemmung der LMP1-Expression durch das DNAzym die Bindung des NF-κB-Transkriptionsfaktors an den ATM-Promotor abschwächte. Weitere Beweise zeigten, dass die Radiosensitivität wiederhergestellt wurde, wenn die ATM-Expression durch siRNA in NPCs niedergeschlagen wurde. Zusammengenommen unterstützen alle unsere Daten unsere Hypothese und bieten eine solide experimentelle Grundlage für die Verwendung von LMP1-gerichteten DNAzymen als potenzielle Radiosensibilisatoren zur Behandlung von EBV-assoziierten Karzinomen.

Toxikologische Studien an Mäusen zeigten, dass in keiner der Dosierungsgruppen im Verlauf der Studie (50 mg, 100 mg und 200 mg/kg) Morbidität oder Mortalität beobachtet wurde. Alle hämatologischen Werte und biochemischen Ergebnisse aus Leber- und Nierenfunktionstests waren normal. In keiner Gruppe wurden in Leber, Milz und Niere mikroskopische Läsionen gefunden, die der Behandlung mit dem modifizierten DNAzyme-Oligonukleotid zugeschrieben werden konnten. Nach i.v. Verabreichung von 100 mg/kg DNAzyme-Oligonukleotid bei Mäusen, die maximale Plasmakonzentration von 24,13 ± 2,6 μg/ml wurde erreicht. Die Abnahme der Plasmakonzentration von DNAzyme folgte einem biexponentiellen Muster mit einer anfänglichen Verteilungshalbwertszeit (t1/2α) von 0,18 ± 0,03 h und eine terminale Halbwertszeit (t1/2β) von 2,55 ± 1,0 h, und die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (AUC) betrug 54,17 ± 9,1 μg.h/ml.

STUDIENAUFBAU Bei dieser Studie handelt es sich um eine randomisierte, doppelblinde und Placebo-kontrollierte klinische Phase-I/II-Studie. Vierzig (40) Patienten werden randomisiert einer von zwei Gruppen gleicher Größe zugeteilt: Placebo-Gruppe, die Kochsalzlösung durch Intra-Tumor-Injektion und Standard-Strahlentherapie erhält; oder DZ1-Gruppe, die LMP1-DNAzyme (DZ1) und Standardstrahlentherapie erhält. Die Placebogruppe bildet die Grundlage für die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von DZ1.

Die Patienten erhalten sieben Wochen lang zwei (2) Stunden vor der radikalen Strahlentherapie am Montag und Donnerstag eine Placebo- oder DZ1-Injektion. Die radikale Strahlentherapie wird den Patienten 5 Mal pro Woche mit 2 Gy jeder Behandlung verabreicht. Das gesamte Verfahren dauert sieben Wochen.

Alle Patienten schließen die Studie 104 Wochen nach der ersten Injektion ab. Die Patienten werden in den ersten sieben Wochen wöchentlich untersucht und getestet, dann alle drei Monate von Woche 8 bis Woche 104.

Die Studie umfasst Bewertungen der Sicherheit und Verträglichkeit: