Klinisk studie av EBV-LMP1 målrettet DNAzyme for å behandle nasofaryngealt karsinom (NPC-DZ)

INNLEDNING Nasofaryngeal karsinom (NPC) er et alvorlig helseproblem over hele verden, spesielt i den sørkinesiske befolkningen, med en forekomstrate fra 15 til 50 per 100 000. NPC er en epitelial malignitet med slående rasemessige og geografiske distribusjonsforskjeller. Høy forekomst er observert i den sørøst-kinesiske befolkningen, og lignende forekomster er rapportert hos disse menneskene uansett hvor de har migrert, inkludert Singapore, Taiwan og Hong Kong. Denne forekomsten er nesten 100 ganger høyere enn i hvite populasjoner. Den mest unike egenskapen til NPC er dens nesten universelle assosiasjon med infeksjonen av Epstein-Barr-virus (EBV), som er det første humane viruset som er identifisert for å være involvert i patogenesen av flere maligniteter og har en spesielt nær tilknytning til NPC, som EBV genom kan påvises i praktisk talt alle NPC-celler. Mens strålebehandling har vært førstelinjebehandlingen for NPC, er radioresistens fortsatt et betydelig klinisk problem for NPC-strålebehandlingen. Det er således udekkede medisinske behov for å oppdage og utvikle nye radiosensibilisatorer for NPC-terapi.

EBV-infeksjon i NPC er klassifisert som type II latent infeksjon der bare EBV kjerneantigen-1 (EBNA-1), latent membranprotein-1 (LMP1), LMP2 og EBV tidlig RNA (EBER) uttrykk kan påvises. Blant disse proteinene antas LMP1 å spille en nøkkelrolle i patogenesen til NPC. Som et 60 kD integrert membranprotein, fungerer LMP1 som en konstitutivt aktiv tumornekrosefaktorreseptor (TNFR), og bidrar til flere aspekter av NPC gjennom å aktivere en rekke signalveier inkludert kjernefaktor NF-kB, aktivatorprotein-1 (AP-1) ), og Janus kinase/signaltransduser og aktivator av transkripsjon (JAK/STAT). Aktivering av NF-kB eller AP-1 av LMP1 har vært knyttet til oppregulering av noen cellulære proteiner og hemming av apoptose. Avhengig av celletypene har uttrykk av LMP1 vist seg å spille forskjellige roller som respons på biologisk og fysiologisk stimulus. Det fungerer som et primært onkoprotein for immortalisering av humane celler og er også vist som det eneste EBV-kodede produktet som kan transformere gnagerfibroblastcellelinje, humane epitelceller og keratinocytter.

Gitt den kritiske rollen til virale onkoproteiner i transformasjon og apoptose, vil undertrykkelse av noen virale onkoproteiner gi en fornuftig strategi for genetisk behandling av NPC. Antisense-oligonukleotider mot LMP1 eller EBNA1 har faktisk vist seg å hemme viralt onkoproteinekspresjon, indusere apoptose og sensibilisere de EBV-positive cellene for cytotoksiske midler. Nylig indikerte noen eksperimentelle studier at RNA-interferensen mot LMP1 viste en anti-proliferativ og anti-metastaseeffekt i LMP1-uttrykkende NPC-er. Disse resultatene antydet at EBV-kodet LMP1 kan presentere et potensielt molekylært mål for behandling av EBV-assosierte karsinomer.

DNAzymer er syntetiske, enkelttrådede DNA-oligonukleotider som kan konstrueres til å binde seg til deres komplementære sekvens i et målbudbringer-RNA (mRNA) gjennom Watson-Crick-baseparing og spalte mRNA ved forhåndsbestemte fosfodiesterbindinger. En generell modell for DNAzyme har blitt foreslått, og er kjent som ''10-23''-modellen. Et ''10-23'' DNAzyme har et katalytisk domene på 15 deoksyribonukleotider, flankert av to substratgjenkjenningsdomener på syv til ni deoksyribonukleotider ved hver arm. In vitro-analyser viste at denne typen DNAzyme effektivt kunne spalte substrat-RNA ved purin: pyrimidin-kryss under fysiologiske forhold. Disse midlene har blitt brukt i en rekke in vitro og in vivo applikasjoner for å hemme ekspresjonen av deres målgener og de avhengige gener. Deres evne til å blokkere utviklingen av et mangfold av patologier i dyremodeller antyder at DNAzymer kan brukes som terapeutiske midler.

For å utvikle EBV-LMP1 målrettede DNAzymer for NPC-behandling, viste vi at de fosfortioat-modifiserte ''10-23'' DNAzymene spesifikt målrettet mot LMP1 mRNA kunne betydelig nedregulere uttrykket av LMP1 i en nasofaryngeal karsinomcelle (NPC) og påvirket nedstrømsbanene aktivert av LMP1, inkludert NF-KB-banen. Det ble også demonstrert at undertrykkelse av LMP1-ekspresjonen av det LMP1-målrettede DNAzyme DZ1 kunne øke radiosensitiviteten både in vivo og vitro. Radioresistens har vært en av hindringene i kliniske omgivelser for effektiv kreftbehandling, som antas å være assosiert med flere signalveier i forskjellige krefttyper. ATM (ataxia telangiectasia mutated) er en nukleær 350 kDa proteinkinase med et karboksylterminalt fosfatidylinositol 3-kinase-lignende kinasedomene[1]. Den fungerer som et medlem av et koordinert system som oppdager DNA-brudd; arresterer cellene midlertidig ved G1-, S- eller G2-kontrollpunkter; og aktiverer DNA-reparasjon. Celler som mangler funksjonelt ATM-protein viser økt følsomhet for ioniserende stråling (IR) og andre genotoksiske hendelser. NF-KB (kjernefaktor kappa B) kan aktivere et stort antall gener involvert i stressresponser, betennelse og programmert celledød (apoptose). P50-homodimerer eller p50/p65- eller p50/c-Rel-heterodimerer binder seg til NF-KB-DNA-bindingsstedene i promoterregionene til mange stress-responsive gener, noe som antyder et komplekst gen- og fysiologisk reguleringsnettverk kontrollert av NF-KB i stressrespons. Den forhøyede basale NF-KB-aktiviteten i visse kreftformer har vært knyttet til tumorresistens mot kjemoterapi og stråling. Hemming av NF-KB blokkerte den adaptive radioresistensen. Våre studier for den molekylære mekanismen til LMP1-DNAzyme-mediert radiosensibilisering avslørte at LMP1 aktiverte ATM-ekspresjonen gjennom NF-KB-veien og inhibering av LMP1-ekspresjon av DNAzyme svekket bindingen av NF-KB-transkripsjonsfaktor til ATM-promoteren. Ytterligere bevis viste at radiosensitiviteten ble gjenvunnet da ATM-uttrykket ble slått ned av siRNA i NPC-er. Sammen støtter alle våre data hypotesen vår og gir et solid eksperimentelt grunnlag for bruk av LMP1-målrettede DNAzymer som potensielle radiosensibilisatorer for behandling av EBV-assosierte karsinomer.

Toksikologiske studier på mus viste at ingen morbiditet eller dødelighet ble observert i noen av doseringsgruppene i løpet av studien (50 mg, 100 mg og 200 mg/kg). Alle hematologiske verdier og biokjemiresultater fra tester av lever- og nyrefunksjon var normale. Ingen mikroskopisk lesjon som kunne tilskrives den modifiserte DNAzyme-oligonukleotidbehandlingen ble funnet i lever, milt og nyre i noen grupper. Etter i.v. administrering av 100 mg/kg DNAzyme-oligonukleotid i mus, maksimal plasmakonsentrasjon på 24,13±2,6μg/ml ble oppnådd. Nedgangen i plasmakonsentrasjonen av DNAzyme fulgte et bi-eksponensielt mønster med initial distribusjonshalveringstid (t1/2α) på 0,18±0,03 h og en terminal halveringstid (t1/2β) på 2,55±1,0 time, og arealet under plasmakonsentrasjon-tid-kurven (AUC) var 54,17±9,1μg.t/ml.

STUDIEDESIGN Denne studien vil være en randomisert, dobbeltblindet og placebokontrollert klinisk fase I/II studie. Førti (40) pasienter vil bli randomisert til en av to grupper av like størrelse: placebogruppe som får saltvann ved intra-tumorinjeksjon og standard strålebehandling; eller DZ1-gruppe som mottar LMP1 DNAzyme (DZ1) og standard strålebehandling. Placebogruppen skal gi grunnlag for vurdering av sikkerhet og effekt av DZ1.

Pasienter får placebo- eller DZ1-injeksjon to (2) timer før radikal strålebehandling mandag og torsdag over syv uker. Den radikale strålebehandlingen gis til pasienter 5 ganger per uke med 2 Gy av hver behandling. Hele prosedyren varer i syv uker.

Alle pasienter vil fullføre studien 104 uker etter første injeksjon. Pasientene vil gjennomgå vurdering og testing hver uke de første syv ukene, deretter hver tredje måned fra uke 8 til uke 104.

Studien vil inkludere evalueringer av sikkerhet og tolerabilitet: