Estudio clínico de la ADNzima dirigida a EBV-LMP1 para tratar el carcinoma nasofaríngeo (NPC-DZ)

INTRODUCCIÓN El carcinoma de nasofaringe (NPC) es un grave problema de salud en todo el mundo, particularmente en la población del sur de China, con una tasa de incidencia que oscila entre 15 y 50 por 100 000. NPC es una neoplasia maligna epitelial con una sorprendente distribución racial y geográfica diferencias. Se observan altas tasas de incidencia en la población del sureste de China, y se han informado tasas similares en estas personas dondequiera que hayan emigrado, incluidos Singapur, Taiwán y Hong Kong. Esta incidencia es casi 100 veces mayor que en las poblaciones blancas. La característica más singular de NPC es su asociación casi universal con la infección por el virus de Epstein-Barr (EBV), que es el primer virus humano identificado que está involucrado en la patogénesis de varias neoplasias malignas y tiene una asociación particularmente estrecha con NPC, como EBV. El genoma se puede detectar en prácticamente todas las células NPC. Si bien la radioterapia ha sido el tratamiento de primera línea para la NPC, la radiorresistencia sigue siendo un problema clínico significativo para la radioterapia de la NPC. Por lo tanto, existen necesidades médicas insatisfechas para descubrir y desarrollar nuevos radiosensibilizadores para la terapia NPC.

La infección por EBV en NPC se clasifica como infección latente de tipo II en la que solo se pueden detectar expresiones de antígeno nuclear 1 de EBV (EBNA-1), proteína de membrana latente 1 (LMP1), LMP2 y ARN temprano de EBV (EBER). Entre estas proteínas, se cree que LMP1 desempeña un papel clave en la patogénesis de NPC. Como una proteína de membrana integral de 60 kD, LMP1 funciona como un receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) constitutivamente activo y contribuye a múltiples aspectos de la NPC mediante la activación de una serie de vías de señalización, incluido el factor nuclear NF-κB, la proteína activadora-1 (AP-1 ), y Janus quinasa/transductor de señales y activador de la transcripción (JAK/STAT). La activación de NF-kB o AP-1 por LMP1 se ha relacionado con la regulación positiva de algunas proteínas celulares y la inhibición de la apoptosis. Según los tipos de células, se ha demostrado que la expresión de LMP1 desempeña diferentes funciones en respuesta a estímulos biológicos y fisiológicos. Actúa como una oncoproteína primaria para la inmortalización de células humanas y también se muestra como el único producto codificado por EBV que puede transformar la línea celular de fibroblastos de roedores, las células epiteliales humanas y los queratinocitos.

Dado el papel fundamental de las oncoproteínas virales en la transformación y la apoptosis, la supresión de algunas oncoproteínas virales proporcionaría una estrategia sensata para tratar genéticamente la NPC. De hecho, se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido contra LMP1 o EBNA1 inhiben la expresión de oncoproteínas virales, inducen la apoptosis y sensibilizan las células positivas para EBV a los agentes citotóxicos. Recientemente, algunos estudios experimentales indicaron que la interferencia del ARN contra LMP1 exhibió un efecto antiproliferativo y antimetástasis en NPC que expresan LMP1. Estos resultados sugirieron que LMP1 codificado por EBV puede presentar un objetivo molecular potencial para el tratamiento de carcinomas asociados con EBV.

Las ADNzimas son oligonucleótidos de ADN monocatenario sintéticos que se pueden diseñar para unirse a su secuencia complementaria en un ARN mensajero (ARNm) objetivo a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick y escindir el ARNm en enlaces fosfodiéster predeterminados. Se ha propuesto un modelo general para la ADNzima, y ​​se conoce como modelo ''10-23''. Una ADNzima ''10-23'' tiene un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueado por dos dominios de reconocimiento de sustrato de siete a nueve desoxirribonucleótidos en cada brazo. Los análisis in vitro demostraron que este tipo de ADNzima podría escindir eficazmente su sustrato de ARN en las uniones purina:pirimidina en condiciones fisiológicas. Estos agentes se han utilizado en varias aplicaciones in vitro e in vivo para inhibir la expresión de sus genes diana y los genes dependientes. Su capacidad para bloquear el desarrollo de una amplia gama de patologías en modelos animales sugiere que las ADNzimas se pueden utilizar como agentes terapéuticos.

Para desarrollar ADNzimas dirigidas a EBV-LMP1 para el tratamiento de NPC, demostramos que las ADNzimas "10-23" modificadas con fosforotioato dirigidas específicamente al ARNm de LMP1 podrían regular significativamente a la baja la expresión de LMP1 en una célula de carcinoma nasofaríngeo (NPC) y afectó las vías aguas abajo activadas por LMP1, incluida la vía NF-κB. También se demostró que la supresión de la expresión de LMP1 por la ADNzima DZ1 dirigida a LMP1 podría mejorar la radiosensibilidad tanto in vivo como in vitro. La radiorresistencia ha sido uno de los impedimentos en entornos clínicos para una terapia eficaz contra el cáncer, que se cree que está asociada con múltiples vías de señalización en diferentes tipos de cáncer. ATM (ataxia telangiectasia mutada) es una proteína quinasa nuclear de 350 kDa con un dominio de quinasa similar a fosfatidilinositol 3-quinasa carboxilo terminal [1]. Funciona como miembro de un sistema coordinado que detecta roturas de ADN; detiene las celdas temporalmente en los puntos de control G1, S o G2; y activa la reparación del ADN. Las células que carecen de proteína ATM funcional muestran una mayor sensibilidad a la radiación ionizante (IR) y otros eventos genotóxicos. El NF-κB (factor nuclear kappa B) puede activar un gran número de genes implicados en las respuestas al estrés, la inflamación y la muerte celular programada (apoptosis). Los homodímeros P50 o los heterodímeros p50/p65 o p50/c-Rel se unen a los sitios de unión al ADN de NF-κB en las regiones promotoras de muchos genes sensibles al estrés, lo que sugiere una compleja red de regulación fisiológica y génica controlada por NF-κB en respuesta al estrés. La elevada actividad basal de NF-κB en ciertos tipos de cáncer se ha relacionado con la resistencia del tumor a la quimioterapia y la radiación. La inhibición de NF-κB bloqueó la radiorresistencia adaptativa. Nuestros estudios sobre el mecanismo molecular de la radiosensibilización mediada por LMP1-DNAzima revelaron que LMP1 activó la expresión de ATM a través de la vía NF-κB y que la inhibición de la expresión de LMP1 por la ADNzima atenuó la unión del factor de transcripción NF-κB al promotor de ATM. Más evidencia mostró que la radiosensibilidad se recuperó cuando la expresión de ATM fue eliminada por siRNA en NPC. Juntos, todos nuestros datos respaldan nuestra hipótesis y proporcionan una base experimental sólida para el uso de ADNzimas dirigidas a LMP1 como radiosensibilizadores potenciales para el tratamiento de los carcinomas asociados con EBV.

Los estudios toxicológicos en ratones mostraron que no se observó morbilidad ni mortalidad en ninguno de los grupos de dosificación durante el transcurso del estudio (50 mg, 100 mg y 200 mg/kg). Todos los valores hematológicos y los resultados bioquímicos de las pruebas de función hepática y renal fueron normales. No se encontró ninguna lesión microscópica que pudiera atribuirse al tratamiento con oligonucleótidos de ADNzima modificado en hígado, bazo y riñón en ningún grupo. Después de i.v. administración de 100 mg/kg de oligonucleótido de ADNzima en ratones, la concentración plasmática máxima de 24,13 ± 2,6 μg/ml fue logrado. La disminución de la concentración plasmática de ADNzima siguió un patrón biexponencial con una vida media de distribución inicial (t1/2α) de 0,18±0,03 h y una vida media terminal (t1/2β) de 2,55±1,0 h, y el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo (AUC) fue de 54,17±9,1 μg.h/ml.

DISEÑO DEL ESTUDIO Este estudio será un ensayo clínico de Fase I/II aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo. Cuarenta (40) pacientes serán asignados aleatoriamente a uno de dos grupos de igual tamaño: grupo placebo que recibe solución salina mediante inyección intratumoral y radioterapia estándar; o grupo DZ1 que recibe LMP1 DNAzyme (DZ1) y radioterapia estándar. El grupo de placebo proporcionará la base para la evaluación de la seguridad y eficacia de DZ1.

Los pacientes reciben una inyección de placebo o DZ1 dos (2) horas antes de la radioterapia radical los lunes y jueves durante siete semanas. La radioterapia radical se administra a los pacientes 5 veces por semana con 2 Gy de cada tratamiento. Todo el procedimiento dura siete semanas.

Todos los pacientes completarán el estudio 104 semanas después de la primera inyección. Los pacientes se someterán a evaluaciones y pruebas cada semana durante las primeras siete semanas, luego cada tres meses desde la semana 8 hasta la semana 104.

El estudio incluirá evaluaciones de seguridad y tolerabilidad: