Étude clinique de l'ADNzyme ciblée par EBV-LMP1 pour traiter le carcinome du nasopharynx (NPC-DZ)

INTRODUCTION Le carcinome nasopharyngé (NPC) est un problème de santé grave dans le monde, en particulier dans la population du sud de la Chine, avec un taux d'incidence allant de 15 à 50 pour 100 000. Le NPC est une tumeur maligne épithéliale avec des différences de distribution raciale et géographique frappantes. Des taux d'incidence élevés sont observés dans la population du sud-est de la Chine, et des taux similaires ont été signalés chez ces personnes partout où elles ont migré, notamment à Singapour, à Taïwan et à Hong Kong. Cette incidence est presque 100 fois plus élevée que dans les populations blanches. La caractéristique la plus unique de NPC est son association presque universelle avec l'infection par le virus d'Epstein-Barr (EBV), qui est le premier virus humain identifié comme étant impliqué dans la pathogenèse de plusieurs tumeurs malignes et a une association particulièrement étroite avec NPC, car EBV génome peut être détecté dans pratiquement toutes les cellules NPC. Bien que la radiothérapie ait été le traitement de première intention des NPC, la radiorésistance reste un problème clinique important pour la radiothérapie des NPC. Ainsi, il existe des besoins médicaux non satisfaits pour découvrir et développer de nouveaux radiosensibilisateurs pour la thérapie NPC.

L'infection à EBV chez NPC est classée comme infection latente de type II dans laquelle seules les expressions de l'antigène nucléaire EBV-1 (EBNA-1), de la protéine membranaire latente-1 (LMP1), LMP2 et de l'ARN précoce EBV (EBER) peuvent être détectées. Parmi ces protéines, on pense que LMP1 joue un rôle clé dans la pathogenèse des NPC. En tant que protéine membranaire intégrale de 60 kD, LMP1 fonctionne comme un récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR) constitutivement actif et contribue à de multiples aspects du NPC en activant un certain nombre de voies de signalisation, notamment le facteur nucléaire NF-κB, la protéine activatrice-1 (AP-1 ), et Janus kinase/transducteur de signal et activateur de transcription (JAK/STAT). L'activation de NF-kB ou AP-1 par LMP1 a été liée à la régulation à la hausse de certaines protéines cellulaires et à l'inhibition de l'apoptose. Selon les types de cellules, il a été démontré que l'expression de LMP1 joue différents rôles en réponse à des stimuli biologiques et physiologiques. Il agit comme une oncoprotéine primaire pour l'immortalisation des cellules humaines et est également présenté comme le seul produit codé par l'EBV capable de transformer la lignée cellulaire de fibroblastes de rongeurs, les cellules épithéliales humaines et les kératinocytes.

Compte tenu du rôle critique des oncoprotéines virales dans la transformation et l'apoptose, la suppression de certaines oncoprotéines virales fournirait une stratégie sensée pour traiter génétiquement les NPC. En effet, il a été démontré que les oligonucléotides antisens contre LMP1 ou EBNA1 inhibent l'expression des oncoprotéines virales, induisent l'apoptose et sensibilisent les cellules EBV-positives aux agents cytotoxiques. Récemment, certaines études expérimentales ont indiqué que l'interférence ARN contre LMP1 présentait un effet anti-prolifératif et anti-métastase dans les PNJ exprimant LMP1. Ces résultats suggèrent que la LMP1 codée par l'EBV peut présenter une cible moléculaire potentielle pour le traitement des carcinomes associés à l'EBV.

Les DNAzymes sont des oligonucléotides d'ADN synthétiques simple brin qui peuvent être modifiés pour se lier à leur séquence complémentaire dans un ARN messager cible (ARNm) par appariement de bases Watson-Crick et cliver l'ARNm à des liaisons phosphodiester prédéterminées. Un modèle général pour la DNAzyme a été proposé, et est connu sous le nom de modèle « 10-23 ». Un '' 10-23 '' DNAzyme a un domaine catalytique de 15 désoxyribonucléotides, flanqué de deux domaines de reconnaissance de substrat de sept à neuf désoxyribonucléotides à chaque bras. Des analyses in vitro ont montré que ce type de DNAzyme pouvait cliver efficacement son ARN substrat au niveau des jonctions purine : pyrimidine dans des conditions physiologiques. Ces agents ont été utilisés dans un certain nombre d'applications in vitro et in vivo pour inhiber l'expression de leurs gènes cibles et des gènes dépendants. Leur capacité à bloquer le développement d'un large éventail de pathologies dans des modèles animaux suggère que les DNAzymes peuvent être utilisées comme agents thérapeutiques.

Pour développer des DNAzymes ciblées par EBV-LMP1 pour le traitement des NPC, nous avons montré que les DNAzymes '' 10-23 '' modifiées au phosphorothioate spécifiquement ciblées sur l'ARNm de LMP1 pouvaient réguler à la baisse de manière significative l'expression de LMP1 dans une cellule de carcinome du nasopharynx (NPC) et ont affecté les voies en aval activées par LMP1, y compris la voie NF-κB. Il a également été démontré que la suppression de l'expression de LMP1 par la DNAzyme DZ1 ciblée par LMP1 pouvait améliorer la radiosensibilité à la fois in vivo et vitro. La radiorésistance a été l'un des obstacles dans les milieux cliniques pour un traitement efficace du cancer, qui serait associé à de multiples voies de signalisation dans différents types de cancer. L'ATM (ataxia telangiectasia mutated) est une protéine kinase nucléaire de 350 kDa avec un domaine kinase de type phosphatidylinositol 3-kinase carboxylterminal [1]. Il fonctionne comme membre d'un système coordonné qui détecte les ruptures d'ADN ; arrête temporairement les cellules aux points de contrôle G1, S ou G2 ; et active la réparation de l'ADN. Les cellules dépourvues de protéine ATM fonctionnelle présentent une sensibilité accrue aux rayonnements ionisants (IR) et à d'autres événements génotoxiques. Le NF-κB (facteur nucléaire kappa B) peut activer un grand nombre de gènes impliqués dans les réponses au stress, l'inflammation et la mort cellulaire programmée (apoptose). Les homodimères P50 ou les hétérodimères p50/p65 ou p50/c-Rel se lient aux sites de liaison à l'ADN de NF-κB dans les régions promotrices de nombreux gènes sensibles au stress, suggérant un gène complexe et un réseau de régulation physiologique contrôlé par NF-κB en réponse au stress. L'activité basale élevée de NF-κB dans certains cancers a été liée à la résistance des tumeurs à la chimiothérapie et à la radiothérapie. L'inhibition de NF-κB a bloqué la radiorésistance adaptative. Nos études sur le mécanisme moléculaire de la radiosensibilisation médiée par LMP1-DNAzyme ont révélé que LMP1 activait l'expression de l'ATM via la voie NF-κB et que l'inhibition de l'expression de LMP1 par la DNAzyme atténuait la liaison du facteur de transcription NF-κB au promoteur ATM. D'autres preuves ont montré que la radiosensibilité a été récupérée lorsque l'expression de l'ATM a été renversée par l'ARNsi dans les PNJ. Ensemble, toutes nos données étayent notre hypothèse et fournissent une base expérimentale solide pour l'utilisation d'ADNzymes ciblées sur LMP1 comme radiosensibilisateurs potentiels pour le traitement des carcinomes associés à l'EBV.

Des études toxicologiques chez la souris ont montré qu'aucune morbidité ou mortalité n'a été observée dans aucun des groupes de dosage au cours de l'étude (50 mg, 100 mg et 200 mg/kg). Toutes les valeurs hématologiques et les résultats biochimiques des tests de la fonction hépatique et rénale étaient normaux. Aucune lésion microscopique pouvant être attribuée au traitement à l'oligonucléotide DNAzyme modifié n'a été trouvée dans le foie, la rate et les reins dans tous les groupes. Après i.v. administration de 100 mg/kg d'oligonucléotide DNAzyme chez la souris, la concentration plasmatique maximale de 24,13 ± 2,6 μg/ml a été atteint. La diminution de la concentration plasmatique de DNAzyme a suivi un schéma bi-exponentiel avec une demi-vie de distribution initiale (t1/2α) de 0,18 ± 0,03 h et une demi-vie terminale (t1/2β) de 2,55±1,0 h, et l'aire sous la courbe concentration plasmatique-temps (ASC) était de 54,17 ± 9,1 μg.h/ml.

CONCEPTION DE L'ÉTUDE Cette étude sera un essai clinique de phase I/II randomisé, en double aveugle et contrôlé par placebo. Quarante (40) patients seront randomisés dans l'un des deux groupes de taille égale : groupe placebo recevant une solution saline par injection intra-tumorale et radiothérapie standard ; ou groupe DZ1 recevant LMP1 DNAzyme (DZ1) et radiothérapie standard. Le groupe placebo servira de base à l'évaluation de l'innocuité et de l'efficacité du DZ1.

Les patients reçoivent un placebo ou une injection de DZ1 deux (2) heures avant la radiothérapie radicale le lundi et le jeudi pendant sept semaines. La radiothérapie radicale est administrée aux patients 5 fois par semaine avec 2 Gy de chaque traitement. L'ensemble de la procédure dure sept semaines.

Tous les patients termineront l'étude 104 semaines après la première injection. Les patients subiront une évaluation et des tests chaque semaine au cours des sept premières semaines, puis tous les trois mois de la semaine 8 à la semaine 104.

L'étude comprendra des évaluations de l'innocuité et de la tolérabilité :