Badanie kliniczne DNAzymu ukierunkowanego na EBV-LMP1 w leczeniu raka nosogardzieli (NPC-DZ)

WPROWADZENIE Rak nosowo-gardłowy (NPC) jest poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie, szczególnie w populacji południowych Chin, z częstością występowania od 15 do 50 na 100 000. NPC jest nowotworem nabłonkowym z uderzającymi różnicami w rozmieszczeniu rasowym i geograficznym. Wysokie wskaźniki zachorowalności obserwuje się w południowo-wschodniej populacji Chin, a podobne wskaźniki odnotowano u tych osób wszędzie tam, gdzie migrowały, w tym w Singapurze, na Tajwanie i w Hongkongu. Częstość ta jest prawie 100-krotnie wyższa niż w populacjach rasy białej. Najbardziej unikalną cechą NPC jest jego niemal powszechny związek z infekcją wirusem Epsteina-Barra (EBV), który jest pierwszym ludzkim wirusem zidentyfikowanym jako zaangażowany w patogenezę kilku nowotworów złośliwych i ma szczególnie bliski związek z NPC, ponieważ EBV genom można wykryć praktycznie we wszystkich komórkach NPC. Podczas gdy radioterapia była leczeniem pierwszego rzutu w przypadku NPC, radiooporność pozostaje istotnym problemem klinicznym w przypadku radioterapii NPC. W związku z tym istnieją niezaspokojone potrzeby medyczne w zakresie odkrywania i opracowywania nowych radiosensybilizatorów do terapii NPC.

Infekcja EBV u NPC jest klasyfikowana jako utajona infekcja typu II, w której można wykryć tylko ekspresję antygenu jądrowego EBV-1 (EBNA-1), utajonego białka błonowego-1 (LMP1), LMP2 i wczesnego RNA EBV (EBER). Wśród tych białek uważa się, że LMP1 odgrywa kluczową rolę w patogenezie NPC. Jako integralne białko błonowe o masie cząsteczkowej 60 kD, LMP1 działa jako konstytutywnie aktywny receptor czynnika martwicy nowotworu (TNFR) i przyczynia się do wielu aspektów NPC poprzez aktywację szeregu szlaków sygnałowych, w tym czynnika jądrowego NF-κB, białka aktywatora-1 (AP-1 ) oraz kinaza janusowa/przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji (JAK/STAT). Aktywacja NF-kB lub AP-1 przez LMP1 została powiązana z regulacją w górę niektórych białek komórkowych i hamowaniem apoptozy. Wykazano, że w zależności od typu komórek ekspresja LMP1 odgrywa różne role w odpowiedzi na bodźce biologiczne i fizjologiczne. Działa jako podstawowa onkoproteina do unieśmiertelniania komórek ludzkich i jest również pokazana jako jedyny produkt kodowany przez EBV, który może transformować linię komórkową fibroblastów gryzoni, ludzkie komórki nabłonkowe i keratynocyty.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę wirusowych onkoprotein w transformacji i apoptozie, supresja niektórych wirusowych onkoprotein zapewniłaby rozsądną strategię genetycznego leczenia NPC. Rzeczywiście, wykazano, że antysensowne oligonukleotydy przeciwko LMP1 lub EBNA1 hamują ekspresję wirusowej onkoproteiny, indukują apoptozę i uwrażliwiają komórki dodatnie pod względem EBV na środki cytotoksyczne. Ostatnio niektóre badania eksperymentalne wykazały, że interferencja RNA przeciwko LMP1 wykazywała efekt antyproliferacyjny i przeciw przerzutom w NPC eksprymujących LMP1. Wyniki te sugerują, że LMP1 kodowany przez EBV może stanowić potencjalny cel molekularny do leczenia raków związanych z EBV.

DNAzymy to syntetyczne, jednoniciowe oligonukleotydy DNA, które można zmodyfikować tak, aby wiązały się z ich komplementarną sekwencją w docelowym informacyjnym RNA (mRNA) poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka i rozszczepiały mRNA we wcześniej określonych wiązaniach fosfodiestrowych. Zaproponowano ogólny model DNAzymu, znany jako model „10-23”. DNAzym „10-23” ma domenę katalityczną złożoną z 15 dezoksyrybonukleotydów, otoczoną dwiema domenami rozpoznającymi substrat, składającymi się z siedmiu do dziewięciu dezoksyrybonukleotydów na każdym ramieniu. Analizy in vitro wykazały, że ten typ DNAzymu może skutecznie rozszczepiać swój substratowy RNA na połączeniach purynowo-pirymidynowych w warunkach fizjologicznych. Środki te stosowano w wielu zastosowaniach in vitro i in vivo do hamowania ekspresji ich genów docelowych i genów zależnych. Ich zdolność do blokowania rozwoju różnorodnych patologii w modelach zwierzęcych sugeruje, że DNAzymy mogą być stosowane jako środki terapeutyczne.

Aby opracować DNAzymy ukierunkowane na EBV-LMP1 do leczenia NPC, wykazaliśmy, że DNAzymy „10-23” zmodyfikowane fosforotionianami specyficznie ukierunkowane na mRNA LMP1 mogą znacząco obniżyć ekspresję LMP1 w komórce raka nosogardzieli (NPC) i wpłynął na szlaki downstream aktywowane przez LMP1, w tym szlak NF-κB. Wykazano również, że tłumienie ekspresji LMP1 przez ukierunkowany na LMP1 DNAzym DZ1 może zwiększać radiowrażliwość zarówno in vivo, jak i in vitro. Radioodporność była jedną z przeszkód w warunkach klinicznych dla skutecznej terapii przeciwnowotworowej, co uważa się za związane z wieloma szlakami sygnałowymi w różnych typach nowotworów. ATM (zmutowana ataksja teleangiektazja) jest jądrową kinazą białkową o masie cząsteczkowej 350 kDa z domeną podobną do kinazy fosfatydyloinozytolu na końcu karboksylowym [1]. Działa jako członek skoordynowanego systemu wykrywającego pęknięcia DNA; tymczasowo aresztuje komórki w punktach kontrolnych G1, S lub G2; i aktywuje naprawę DNA. Komórki pozbawione funkcjonalnego białka ATM wykazują zwiększoną wrażliwość na promieniowanie jonizujące (IR) i inne zjawiska genotoksyczne. NF-κB (czynnik jądrowy kappa B) może aktywować dużą liczbę genów zaangażowanych w reakcje na stres, zapalenie i zaprogramowaną śmierć komórki (apoptozę). Homodimery P50 lub heterodimery p50/p65 lub p50/c-Rel wiążą się z miejscami wiązania DNA NF-κB w regionach promotorowych wielu genów reagujących na stres, co sugeruje złożoną genową i fizjologiczną sieć regulacyjną kontrolowaną przez NF-κB w odpowiedzi na stres. Podwyższona podstawowa aktywność NF-κB w niektórych nowotworach została powiązana z opornością guza na chemioterapię i promieniowanie. Zahamowanie NF-κB blokowało adaptacyjną oporność na promieniowanie. Nasze badania mechanizmu molekularnego nadwrażliwości na promieniowanie, w której pośredniczy LMP1-DNAzym, ujawniły, że LMP1 aktywował ekspresję ATM poprzez szlak NF-κB, a hamowanie ekspresji LMP1 przez DNAzym osłabiało wiązanie czynnika transkrypcyjnego NF-κB z promotorem ATM. Dalsze dowody wykazały, że wrażliwość na promieniowanie została odzyskana, gdy ekspresja ATM została znokautowana przez siRNA w NPC. Łącznie wszystkie nasze dane potwierdzają naszą hipotezę i dostarczają solidnych podstaw eksperymentalnych do wykorzystania DNAzymów ukierunkowanych na LMP1 jako potencjalnych radiosensybilizatorów do leczenia raków związanych z EBV.

Badania toksykologiczne na myszach wykazały, że w trakcie badania nie zaobserwowano zachorowalności ani śmiertelności w żadnej z grup otrzymujących dawki (50 mg, 100 mg i 200 mg/kg). Wszystkie wartości hematologiczne i wyniki biochemiczne badań czynności wątroby i nerek były prawidłowe. W żadnej grupie nie znaleziono mikroskopijnych uszkodzeń, które można by przypisać działaniu zmodyfikowanego oligonukleotydu DNAzymu w wątrobie, śledzionie i nerkach. po i.v. podawanie myszom 100 mg/kg oligonukleotydu DNAzymu, maksymalne stężenie w osoczu 24,13±2,6 μg/ml zostało osiągnięte. Spadek stężenia DNAzymu w osoczu przebiegał według wzoru dwuwykładniczego z początkowym okresem półtrwania w dystrybucji (t1/2α) wynoszącym 0,18±0,03 hi końcowy okres półtrwania (t1/2β) 2,55±1,0 h, a pole pod krzywą zależności stężenia w osoczu od czasu (AUC) wynosiło 54,17 ± 9,1 μg.h/ml.

PROJEKT BADANIA To badanie będzie randomizowanym, podwójnie zaślepionym i kontrolowanym placebo badaniem klinicznym fazy I/II. Czterdziestu (40) pacjentów zostanie losowo przydzielonych do jednej z dwóch grup o równej liczebności: grupa placebo otrzymująca sól fizjologiczną przez wstrzyknięcie do guza i standardową radioterapię; lub grupa DZ1 otrzymująca DNAzym LMP1 (DZ1) i standardową radioterapię. Grupa placebo będzie stanowić podstawę do oceny bezpieczeństwa i skuteczności DZ1.

Pacjenci otrzymują zastrzyk placebo lub DZ1 na dwie (2) godziny przed radykalną radioterapią w poniedziałek i czwartek przez siedem tygodni. Radioterapię radykalną stosuje się u pacjentów 5 razy w tygodniu po 2 Gy każdego zabiegu. Cała procedura trwa siedem tygodni.

Wszyscy pacjenci zakończą badanie po 104 tygodniach od pierwszego wstrzyknięcia. Pacjenci będą poddawani ocenie i testom co tydzień przez pierwsze siedem tygodni, a następnie co trzy miesiące od 8 do 104 tygodnia.

Badanie będzie obejmowało ocenę bezpieczeństwa i tolerancji: