Klinisk undersøgelse af EBV-LMP1 målrettet DNAzyme til behandling af nasopharyngealt karcinom (NPC-DZ)

INTRODUKTION Nasopharyngeal carcinom (NPC) er et alvorligt sundhedsproblem på verdensplan, især i den sydkinesiske befolkning, med en forekomst på mellem 15 og 50 pr. 100.000. NPC er en epitelial malignitet med en slående racemæssig og geografisk fordeling. Høje forekomster er observeret i den sydøstkinesiske befolkning, og lignende rater er blevet rapporteret hos disse mennesker, uanset hvor de er migreret, herunder Singapore, Taiwan og Hong Kong. Denne forekomst er næsten 100 gange højere end i hvide populationer. Det mest unikke ved NPC er dets næsten universelle forbindelse med infektionen af ​​Epstein-Barr-virus (EBV), som er den første humane virus, der er identificeret til at være involveret i patogenesen af ​​flere maligne sygdomme og har en særlig tæt forbindelse med NPC, som EBV genom kan påvises i stort set alle NPC-celler. Mens strålebehandling har været førstelinjebehandlingen for NPC, er radioresistens fortsat et væsentligt klinisk problem for NPC-strålebehandlingen. Der er således udækkede medicinske behov for at opdage og udvikle nye radiosensibilisatorer til NPC-terapi.

EBV-infektion i NPC er klassificeret som type II latent infektion, hvor kun EBV nuklear antigen-1(EBNA-1), latent membranprotein-1(LMP1), LMP2 og EBV tidligt RNA (EBER) udtryk kan påvises. Blandt disse proteiner menes LMP1 at spille en nøglerolle i patogenesen af ​​NPC. Som et 60 kD integreret membranprotein fungerer LMP1 som en konstitutivt aktiv tumornekrosefaktorreceptor (TNFR) og bidrager til flere aspekter af NPC gennem aktivering af en række signalveje, herunder nuklear faktor NF-KB, aktivatorprotein-1(AP-1) ), og Janus kinase/signaltransducer og aktivator af transkription (JAK/STAT). Aktivering af NF-kB eller AP-1 af LMP1 er blevet forbundet med opregulering af nogle cellulære proteiner og hæmning af apoptose. Afhængigt af celletyperne har ekspression af LMP1 vist sig at spille forskellige roller som reaktion på biologisk og fysiologisk stimulus. Det fungerer som et primært onkoprotein til immortalisering af humane celler og er også vist som det eneste EBV-kodede produkt, der kan transformere gnaverfibroblastcellelinje, humane epitelceller og keratinocytter.

I betragtning af virale oncoproteiners kritiske rolle i transformation og apoptose ville suppression af nogle virale oncoproteiner give en fornuftig strategi til genetisk behandling af NPC. Faktisk har antisense-oligonukleotider mod LMP1 eller EBNA1 vist sig at inhibere viral oncoprotein-ekspression, inducere apoptose og sensibilisere de EBV-positive celler over for cytotoksiske midler. For nylig viste nogle eksperimentelle undersøgelser, at RNA-interferensen mod LMP1 udviste en anti-proliferativ og anti-metastase-effekt i LMP1-udtrykkende NPC'er. Disse resultater antydede, at EBV-kodet LMP1 kan udgøre et potentielt molekylært mål til behandling af EBV-associerede karcinomer.

DNAzymer er syntetiske, enkeltstrengede DNA-oligonukleotider, der kan konstrueres til at binde til deres komplementære sekvens i et målbudbringer-RNA (mRNA) gennem Watson-Crick-baseparring og spalte mRNA'et ved forudbestemte phosphodiester-bindinger. En generel model for DNAzyme er blevet foreslået, og er kendt som ''10-23''-modellen. Et ''10-23'' DNAzyme har et katalytisk domæne på 15 deoxyribonukleotider, flankeret af to substratgenkendelsesdomæner på syv til ni deoxyribonukleotider ved hver arm. In vitro-analyser viste, at denne type DNAzyme effektivt kunne spalte dets substrat-RNA ved purin: pyrimidinforbindelser under fysiologiske forhold. Disse midler er blevet anvendt i en række in vitro og in vivo applikationer til at inhibere ekspressionen af ​​deres målgener og de afhængige gener. Deres evne til at blokere udviklingen af ​​en bred vifte af patologier i dyremodeller tyder på, at DNAzymer kan bruges som terapeutiske midler.

For at udvikle EBV-LMP1-målrettede DNAzymer til NPC-behandling viste vi, at de phosphorthioat-modificerede ''10-23'' DNAzymer specifikt målrettet mod LMP1-mRNA'et kunne signifikant nedregulere ekspressionen af ​​LMP1 i en nasopharyngeal carcinomcelle (NPC) og påvirkede downstream-vejene aktiveret af LMP1, herunder NF-KB-vejen. Det blev også påvist, at undertrykkelse af LMP1-ekspressionen af ​​det LMP1-målrettede DNAzyme DZ1 kunne øge radiosensitiviteten både in vivo og vitro. Radioresistens har været en af ​​hindringerne i kliniske omgivelser for effektiv kræftbehandling, som menes at være forbundet med flere signalveje i forskellige kræfttyper. ATM (ataxia telangiectasia mutated) er en nukleær 350 kDa proteinkinase med et carboxylterminalt phosphatidylinositol 3-kinase-lignende kinasedomæne[1]. Det fungerer som et medlem af et koordineret system, der detekterer DNA-brud; arresterer cellerne midlertidigt ved G1, S eller G2 kontrolpunkter; og aktiverer DNA-reparation. Celler, der mangler funktionelt ATM-protein, viser øget følsomhed over for ioniserende stråling (IR) og andre genotoksiske hændelser. NF-KB (nuklear faktor kappa B) kan aktivere et stort antal gener involveret i stressreaktioner, inflammation og programmeret celledød (apoptose). P50-homodimerer eller p50/p65- eller p50/c-Rel-heterodimerer binder til NF-KB DNA-bindingsstederne i promotorregionerne af mange stress-responsive gener, hvilket tyder på et komplekst gen- og fysiologisk reguleringsnetværk kontrolleret af NF-KB i stressrespons. Den forhøjede basale NF-KB-aktivitet i visse kræftformer er blevet forbundet med tumorresistens over for kemoterapi og stråling. Inhibering af NF-KB blokerede den adaptive radioresistens. Vores undersøgelser af den molekylære mekanisme af LMP1-DNAzyme-medieret radiosensibilisering afslørede, at LMP1 aktiverede ATM-ekspressionen gennem NF-KB-vejen, og inhibering af LMP1-ekspression af DNAzyme svækkede bindingen af ​​NF-KB-transkriptionsfaktor til ATM-promotoren. Yderligere beviser viste, at radiosensitiviteten blev genvundet, da ATM-ekspressionen blev slået ned af siRNA i NPC'er. Tilsammen understøtter alle vores data vores hypotese og giver et solidt eksperimentelt grundlag for brugen af ​​LMP1-målrettede DNAzymer som potentielle radiosensibilisatorer til behandling af de EBV-associerede carcinomer.

Toksikologiske undersøgelser på mus viste, at der ikke blev observeret morbiditet eller dødelighed i nogen af ​​doseringsgrupperne i løbet af undersøgelsen (50 mg, 100 mg og 200 mg/kg). Alle hæmatologiske værdier og biokemiske resultater fra test af lever- og nyrefunktion var normale. Ingen mikroskopisk læsion, der kunne tilskrives den modificerede DNAzyme-oligonukleotidbehandling, blev fundet i lever, milt og nyrer i nogen grupper. Efter i.v. administration af 100 mg/kg DNAzyme-oligonukleotid i mus, den maksimale plasmakoncentration på 24,13±2,6μg/ml blev opnået. Faldet i plasmakoncentrationen af ​​DNAzyme fulgte et bi-eksponentielt mønster med initial distributionshalveringstid (t1/2α) på 0,18±0,03 h og en terminal halveringstid (t1/2β) på 2,55±1,0 time, og arealet under plasmakoncentration-tid-kurven (AUC) var 54,17±9,1μg.h/ml.

STUDIEDESIGN Dette studie vil være et randomiseret, dobbeltblindet og placebokontrolleret klinisk fase I/II-forsøg. Fyrre (40) patienter vil blive randomiseret til en af ​​to grupper af lige størrelse: placebogruppe, der modtager saltvand ved intratumorinjektion og standardstrålebehandling; eller DZ1-gruppe, der modtager LMP1 DNAzyme (DZ1) og standard strålebehandling. Placebogruppen vil danne grundlag for vurdering af sikkerhed og effekt af DZ1.

Patienter får placebo- eller DZ1-injektion to (2) timer før radikal strålebehandling mandag og torsdag over syv uger. Den radikale strålebehandling gives til patienter 5 gange om ugen med 2 Gy af hver behandling. Hele proceduren varer syv uger.

Alle patienter vil afslutte undersøgelsen 104 uger efter den første injektion. Patienterne vil gennemgå vurdering og test hver uge i de første syv uger, derefter hver tredje måned fra uge 8 til uge 104.

Undersøgelsen vil omfatte evalueringer af sikkerhed og tolerabilitet: