Klinická studie EBV-LMP1 cíleného DNAzymu k léčbě nasofaryngeálního karcinomu (NPC-DZ)

ÚVOD Karcinom nosohltanu (NPC) je celosvětově závažným zdravotním problémem, zejména v jižní čínské populaci, s četností výskytu v rozmezí 15 až 50 na 100 000. NPC je epiteliální malignita s výraznými rasovými a geografickými rozdíly v distribuci. Vysoká míra výskytu je pozorována u populace jihovýchodní Číny a podobná míra byla hlášena u těchto lidí bez ohledu na to, kam migrovali, včetně Singapuru, Tchaj-wanu a Hong Kongu. Tento výskyt je téměř 100krát vyšší než u bílé populace. Nejunikátnějším rysem NPC je jeho téměř univerzální spojení s infekcí virem Epstein-Barrové (EBV), který je prvním lidským virem, u kterého bylo zjištěno, že se podílí na patogenezi několika malignit a má obzvláště úzkou souvislost s NPC, jako EBV. genom lze detekovat prakticky ve všech buňkách NPC. Zatímco radioterapie byla léčba první volby pro NPC, radiorezistence zůstává významným klinickým problémem pro radioterapii NPC. Existuje tedy neuspokojená lékařská potřeba objevit a vyvinout nové radiosenzitizéry pro terapii NPC.

Infekce EBV u NPC je klasifikována jako latentní infekce typu II, u které lze detekovat pouze exprese EBV jaderného antigenu-1 (EBNA-1), latentního membránového proteinu-1 (LMP1), LMP2 a EBV časné RNA (EBER). Mezi těmito proteiny se předpokládá, že LMP1 hraje klíčovou roli v patogenezi NPC. Jako 60kD integrální membránový protein funguje LMP1 jako konstitutivně aktivní receptor tumor nekrotizujícího faktoru (TNFR) a přispívá k mnoha aspektům NPC prostřednictvím aktivace řady signálních drah včetně jaderného faktoru NF-κB, aktivátorového proteinu-1 (AP-1). a Janusova kináza/převodník signálu a aktivátor transkripce (JAK/STAT). Aktivace NF-kB nebo AP-1 pomocí LMP1 byla spojena s upregulací některých buněčných proteinů a inhibicí apoptózy. V závislosti na typech buněk se ukázalo, že exprese LMP1 hraje různé role v reakci na biologický a fyziologický stimul. Působí jako primární onkoprotein pro imortalizaci lidských buněk a je také ukázán jako jediný produkt kódovaný EBV, který může transformovat buněčnou linii fibroblastů hlodavců, lidské epiteliální buňky a keratinocyty.

Vzhledem ke kritické roli virových onkoproteinů v transformaci a apoptóze by suprese některých virových onkoproteinů poskytla rozumnou strategii pro genetickou léčbu NPC. Ukázalo se, že antisense oligonukleotidy proti LMP1 nebo EBNA1 inhibují expresi virového onkoproteinu, indukují apoptózu a senzibilizují EBV-pozitivní buňky vůči cytotoxickým činidlům. Nedávno některé experimentální studie ukázaly, že interference RNA proti LMP1 vykazovala antiproliferativní a antimetastázový účinek u NPC exprimujících LMP1. Tyto výsledky naznačují, že LMP1 kódovaný EBV může představovat potenciální molekulární cíl pro léčbu karcinomů spojených s EBV.

DNAzymy jsou syntetické oligonukleotidy jednovláknové DNA, které mohou být upraveny tak, aby se navázaly na svou komplementární sekvenci v cílové messenger RNA (mRNA) prostřednictvím párování bází Watson-Crick a štěpily mRNA na předem určených fosfodiesterových vazbách. Byl navržen obecný model pro DNAzym a je známý jako model ''10-23''. DNAzym ''10-23'' má katalytickou doménu 15 deoxyribonukleotidů, lemovanou dvěma doménami rozpoznávajícími substrát se sedmi až devíti deoxyribonukleotidy na každém rameni. Analýzy in vitro ukázaly, že tento typ DNAzymu může za fyziologických podmínek účinně štěpit svou substrátovou RNA na spojení purin:pyrimidin. Tato činidla byla použita v řadě aplikací in vitro a in vivo k inhibici exprese jejich cílových genů a závislých genů. Jejich schopnost blokovat vývoj různých patologií na zvířecích modelech naznačuje, že DNAzymy mohou být použity jako terapeutická činidla.

Abychom vyvinuli DNAzymy cílené na EBV-LMP1 pro léčbu NPC, ukázali jsme, že fosforothioátem modifikované ''10-23'' DNAzymy specificky zaměřené na mRNA LMP1 by mohly významně snížit expresi LMP1 v buňce nazofaryngeálního karcinomu (NPC) a ovlivnilo down-stream dráhy aktivované LMP1, včetně NF-kB dráhy. Bylo také prokázáno, že potlačení exprese LMP1 pomocí DNAzymu DZ1 cíleného na LMP1 by mohlo zvýšit radiosenzitivitu jak in vivo, tak in vitro. Radiorezistence je jednou z překážek v klinickém prostředí pro účinnou terapii rakoviny, o níž se předpokládá, že je spojena s více signálními cestami u různých typů rakoviny. ATM (ataxia telangiectasia mutated) je jaderná 350-kDa proteinkináza s karboxyterminální fosfatidylinositol 3-kinázovou kinázovou doménou[1]. Funguje jako člen koordinovaného systému, který detekuje zlomy DNA; dočasně zastaví buňky v kontrolních bodech G1, S nebo G2; a aktivuje opravu DNA. Buňky postrádající funkční ATM protein vykazují zvýšenou citlivost na ionizující záření (IR) a další genotoxické jevy. NF-κB (nukleární faktor kappa B) může aktivovat velké množství genů zapojených do stresových reakcí, zánětu a programované buněčné smrti (apoptózy). P50 homodimery nebo p50/p65 nebo p50/c-Rel heterodimery se vážou na vazebná místa NF-KB DNA v promotorových oblastech mnoha genů reagujících na stres, což naznačuje komplexní genovou a fyziologickou regulační síť řízenou NF-KB v reakci na stres. Zvýšená bazální aktivita NF-KB u některých druhů rakoviny byla spojena s odolností nádoru vůči chemoterapii a ozařování. Inhibice NF-KB blokovala adaptivní radiorezistenci. Naše studie molekulárního mechanismu radiosenzibilizace zprostředkované LMP1-DNAzym odhalily, že LMP1 aktivoval expresi ATM cestou NF-κB a inhibice exprese LMP1 pomocí DNAzymu zeslabila vazbu transkripčního faktoru NF-κB na promotor ATM. Další důkaz ukázal, že radiosenzitivita byla obnovena, když byla exprese ATM sražena siRNA v NPC. Všechna naše data společně podporují naši hypotézu a poskytují solidní experimentální základ pro použití DNAzymů cílených na LMP1 jako potenciálních radiosenzitizérů pro léčbu karcinomů spojených s EBV.

Toxikologické studie na myších ukázaly, že v průběhu studie nebyla pozorována žádná morbidita ani mortalita v žádné z dávkovacích skupin (50 mg, 100 mg a 200 mg/kg). Všechny hematologické hodnoty a biochemické výsledky testů jaterních a renálních funkcí byly v normě. V játrech, slezině a ledvinách nebyla v žádné skupině nalezena žádná mikroskopická léze, která by mohla být přisuzována působení modifikovaného oligonukleotidu DNAzymu. Po i.v. podání 100 mg/kg DNAzym oligonukleotidu myším, maximální plazmatická koncentrace 24,13 ± 2,6 μg/ml bylo dosaženo. Snížení plazmatické koncentrace DNAzymu mělo biexponenciální charakter s počátečním distribučním poločasem (t1/2α) 0,18±0,03 ha terminální poločas (t1/2p) 2,55±1,0 h a plocha pod křivkou plazmatické koncentrace-čas (AUC) byla 54,17±9,1μg.h/ml.

NÁVRH STUDIE Tato studie bude randomizovaná, dvojitě zaslepená a placebem kontrolovaná klinická studie fáze I/II. Čtyřicet (40) pacientů bude randomizováno do jedné ze dvou skupin stejné velikosti: skupina s placebem, která dostávala fyziologický roztok intratumorovou injekcí a standardní radioterapií; nebo skupina DZ1, která dostávala LMP1 DNAzyme (DZ1) a standardní radioterapii. Skupina s placebem poskytne základ pro hodnocení bezpečnosti a účinnosti DZ1.

Pacienti dostávají placebo nebo injekci DZ1 dvě (2) hodiny před radikální radiační terapií v pondělí a ve čtvrtek po dobu sedmi týdnů. Radikální radioterapie je pacientům podávána 5x týdně s 2 Gy na každou léčbu. Celá procedura trvá sedm týdnů.

Všichni pacienti dokončí studii 104 týdnů po první injekci. Pacienti podstoupí hodnocení a testování každý týden v prvních sedmi týdnech, poté každé tři měsíce od týdne 8 do týdne 104.

Studie bude zahrnovat hodnocení bezpečnosti a snášenlivosti: