小児肥満における食後のアテローム生成のメカニズム

脂肪量の増加とインスリン抵抗性との関係に関するこれまでの概要の一部は、ヒトでは実験的に証明されていません。 たとえば、ヒトで示されるサイトカインとインスリン感受性との関係のほとんどは相関関係の観察です。

肥満児では脂肪肝が非常に蔓延しており、他の脂肪蓄積よりもインスリン抵抗性、脂質異常症、高血圧、高レベルの炎症マーカーと密接に関連しています。 したがって、全体像は、肥満の小児/青年におけるアテローム性動脈硬化への加速的な傾向と一致しています。 実際、いくつかの報告は、肥満児においてアテローム性動脈硬化の中間的な表現型が検出できることを実証している。 さらに、食後の段階は、アテローム発生においてそれ自体の役割を果たしていると考えられています。

研究者らは、肥満のインスリン抵抗性の小児では、高脂血症、酸化ストレス、副炎症などのアテローム発生のメカニズムが食後の段階で活性化され、その結果血管機能の障害が生じるのではないかと仮説を立てている。

研究中のパラメータ:

1. 誘発剤候補

   • 食後血糖値
   • 食後高脂血症
   • 食後小型高密度LDL
   • 食後インスリン
   • 候補メカニズム
   • 補体の活性化
   • C3

2. 炎症

   • TNF-α
   • インターロイキン-6 (IL-6)
   • インターロイキン-10 (IL-10)
   • C反応性タンパク質（CRP）
   • 酸化ストレス
   • 尿中イソ PGF2 アルファ

3. 中間表現型

   • 頸動脈内膜中膜厚さ（IMT）（ベースラインのみ）
   • 内皮機能 (血流媒介血管拡張) (FMD)
   • 動脈硬化（脈波伝播速度）（PWV）

実験プロトコル 被験者は、一晩絶食した後、午前8時にヴェローナ市立病院の内分泌・代謝疾患部門に到着する。 体重、身長、腹囲、血圧を測定します。 研究全体を通じて、被験者は静かな温度管理された（22℃）部屋のベッドに横たわります。 採血のためにテフロン静脈カテーテルが肘前静脈に挿入され、生理食塩水のゆっくりとした点滴注入によって開存状態が維持されます。 ベースライン状態は、静脈穿刺後ベッドで少なくとも 20 分間休んだ後に達成されたと見なされます。

被験者は少なくとも2週間、血管機能を阻害することが知られている薬物を服用していなければならず、研究の少なくとも24時間前にはカフェインを含む飲料を控えるよう求められます。 収縮期血圧、拡張期血圧、平均動脈圧および心拍数は、研究全体を通じてCardiocap II（Datex、フィンランド）を用いて時間間隔で監視される。

頸動脈大腿部のＰＷＶは、Ｃｏｍｐｌｉｏｒ（Ｃｏｌｓｏｎ、Ｇａｒｇｅｓ ｌｅｓ Ｇｅｎｏｓｓｅ、フランス）を使用して評価される。 頸動脈 IMT は、高解像度の US カラードップラー スキャンによって評価されます。 次に、非優位総大腿動脈の流れ媒介内皮依存性血管拡張を、軸分解能 0.01 mm の 10 MHz 線形血管プローブを使用した高分解能エコー ドップラー (Esaote Biomedica AU6、イタリア、ジェノバ) によって評価します。 ベースライン直径と血流速度、せん断応力の代用値は、少なくとも 3 回評価されます。 この後、血圧測定用カフを膝の下に置き、収縮期血圧よりも 50 mm Hg 高く膨らませ、5 分間維持します。 血管の直径と流速は、研究者の十分に確立されたプロトコールに従って、カフを収縮させてから0.5分、2分、4分、6分、および8分の時点で測定されます。 これらの条件下で、カフが収縮すると、血圧測定用カフの遠位の組織で虚血後の充血が発生します。 この充血は、カフの近位に位置する総大腿動脈の血流速度の増加を引き起こします。 流速の増加とそれに続くせん断応力の増加により、内皮依存性の血管拡張が引き起こされます。 この拡張は NO に依存することが示されています。 血流依存性血管拡張の全体的な定量的指標は、時間の関数としての血管直径の変化曲線の下の面積（8 分間の観察）を計算することによって取得され、絶対値とベースライン血管直径に対するパーセント変化の両方で表されます。 。 研究者らによると、この技術の日間の変動係数 (n=15、広範囲の血管反応をカバー) は 23.0±3.8% です。 研究目的での三硝酸グリセリルの投与は、地域の施設倫理委員会によって子供に対する倫理的に不当であるとみなされるため、内皮非依存性血管拡張は評価されない。

研究者の現在の経験 (n=42 人の重度肥満児) では、一晩絶食後の平均口蹄疫は 1.40±0.91% でした。 8 分あたり (平均±SD)、それによって動的な変化を示すための十分な余地が残されています。 これらの重度の肥満児において、研究者らは口蹄疫とBMIの間に相関関係がないことを発見した。 このペア研究では、技術の再現性を高めることを目的として、アドホック機械式 US プローブ ホルダーが使用されます。 さらに、動脈直径の変化を自動計算するための特定の自動輪郭追跡技術を使用して、この方法のオペレーターへの依存を最小限に抑えます。

ベースライン (約 10 分および 0 分) の血液サンプルを収集して、グルコース、インスリン、C ペプチド、標準脂質プロファイル (総コレステロール、HDL コレステロール、およびトリグリセリド)、酸化 LDL、アディポネクチン、レプチン、C3、TNF を測定します。失血を制限するためのマイクロメソッドによるα、IL-6、IL-10、CRP。 LDL および HDL サブフラクションを測定するために、別のサンプルが収集されます。 ベースライン尿は、細胞膜および LDL 粒子上の酸素フリーラジカルによって触媒される非酵素的脂質過酸化に由来する生成物である iso-PGF2-α を測定するために収集されます (43)。

時間0'で、被験者は既知のカロリー量（体表面積1m2あたり300kcal）および組成（炭水化物53.8％、脂質29.5％、タンパク質16.7％）の混合流動食（Ensure Plus、1.5kcal/cc）を摂取します。 10分以上。 グルコース、インスリン、C ペプチドは +15'、+30'、+45'、+60'、+90'、+120'、+150'、+180'、+210'、+240' で測定されます。そして+300'。 標準脂質と PWV は +60'、+120'、+180'、+240'、+300' で測定されます。 アディポネクチン、レプチン、C3、TNF-α、IL-6、IL-10、CRP、LDL、および HDL サブフラクションは +180' および +300' で測定されます。 +180 分で FMD の評価が繰り返されます。 食事の最後に尿を採取し、8-iso-PGF2-alpha を評価します。

血液サンプルは +4 °C、1500 g で素早く遠心分離され、血漿/血清は収集され、-80 °C で保存されます。尿サンプルは -80 °C で保存されます。総失血量は 100 cc 未満に保たれます。

分析方法 LDL/HDL サブフラクション評価と尿 PGF2α を除き、失血を最小限に抑えるために、少量の血漿/血清を使用するように特に最適化された方法が使用されます。 グルコースは、ベッドサイドで、グルコースオキシダーゼ法により、Yellow Spring Glucose Analyzerを使用して測定されます。 C-ペプチドとインスリンは、社内の ELISA マイクロメソッドによって測定されます。 総コレステロール、HDL コレステロール、および総トリグリセリドは、標準的な社内酵素マイクロメソッドによって評価されます。 アディポネクチン、レプチン、C3、TNF-α、IL-6、IL-10、CRPは、社内の免疫測定マイクロ法によって評価されます。 8-Iso-PGF2α は、尿から抽出した後、免疫測定アッセイによって評価されます。

LDL/HDLサブフラクションは教授の研究室で測定されます。 パドヴァ大学医学部のアルベルト・ザンボン氏。 簡単に説明すると、超遠心管内で不連続な塩密度勾配を作成した後、サンプルを Sorvall TV-865B 垂直ローター内で 10℃、65,000 rpm で 90 分間遠心分離します。 次に、遠心分離管の底から 38 個の 0.45 ml 画分を収集します。 コレステロールは各画分で測定されます。 LDL ピーク浮力を特徴づけ、LDL サイズ/密度の尺度である相対浮遊率 (Rf) は、LDL コレステロール ピークを含む画分数を収集された画分の総数で割ることによって得られます。

ベータ細胞機能の評価

ベータ細胞の機能は、いくつかの研究室が提案した一般的な戦略に若干の変更を加えたものに従って、混合食事試験中にグルコースとCペプチドの曲線を分析することによって評価されます。 簡単に言うと、インスリン分泌は次の 3 つの要素の合計です。

1. 基礎（吸収後）インスリン分泌速度。
2. 血漿グルコースの増加速度に応じたインスリン分泌（「動的」または「派生」分泌成分）。
3. 吸収後のグルコース濃度を超える実際のグルコースレベルに応じたインスリン分泌（「静的」または「比例」分泌成分）。

モデリング戦略の完全な説明は、研究者らの以前の出版物に記載されています。 パラメータは、SAAM 1.1.2 での C ペプチド分泌のこの最小モデルを実装することによって推定されます。 ソフトウェア (SAAM Institute、シアトル、ワシントン州)。 未知のパラメータの数値は、非線形最小二乗法を使用して推定されます。

重みは最適に選択されます。つまり、測定誤差の分散の逆数に等しく、加算的で相関がなく、平均がゼロで変動係数 (CV) が 8% であると仮定されます。

この分析は、食後のアテローム生成プロセスが起こるホルモンのシナリオを提供します。

統計分析 データは平均値±SEMとして要約されます。 サンプルのサイズ (各グループ n=20) は、20 ～ 40% の差について統計的有意性が 80% の確率で得られるように選択されました (最小検出可能な差は、研究対象の変数によって異なります)。 一般推定方程式手順 (GEE) を使用して、反復測定の 2 元配置 ANOVA を実行し、必要に応じて共変量を調整します。 ガウス分布はすべての変数でテストされ、正規性からの統計的に有意な逸脱が見つかった場合は、対数 (またはその他の) 変換が適用されます。 相関関係は、スピアマンの順位相関係数によって求められます。 統計的有意性は p<0.05 で宣言されます。 統計分析は、MacOS X 用の SPSS 12.0 (またはそれ以降) を使用して実行されます。

現在の研究プロジェクトの目標を達成すると、次のことが可能になります。

1. 小児肥満、炎症、インスリン抵抗性、血管機能不全との関係に関する知識を拡大する。
2. 食後高脂血症、食後炎症および/または食後酸化ストレスが、肥満の小児/青年におけるアテローム性動脈硬化症の中間表現型に関連しているかどうかを解明する。
3. 小児/青少年の肥満合併症予防の潜在的な新規標的を確立し、肥満関連障害の治療のための新規ツールを示唆する可能性がある。