Meccanismi di aterogenesi durante il periodo postprandiale nell'obesità infantile

Alcuni dei precedenti schemi delle relazioni tra massa grassa ingrossata e insulino-resistenza non sono stati provati sperimentalmente nell'uomo. Ad esempio, la maggior parte delle relazioni mostrate negli esseri umani tra citochine e sensibilità all'insulina sono osservazioni correlazionali.

Nel bambino obeso, il fegato grasso è piuttosto diffuso ed è più strettamente associato rispetto ad altri depositi di grasso all'insulino-resistenza, alla dislipidemia, all'ipertensione e ad alti livelli di marcatori di infiammazione. L'intero quadro, quindi, è coerente con una spinta accelerata all'aterosclerosi nel bambino/adolescente obeso. In effetti, diversi rapporti hanno dimostrato che i fenotipi intermedi dell'aterosclerosi possono essere rilevati nel bambino obeso. Inoltre, si ritiene che la fase postprandiale svolga un ruolo proprio nell'aterogenesi.

I ricercatori ipotizzano che nel bambino obeso insulino-resistente meccanismi di aterogenesi, quali iperlipemia, stress ossidativo e subinfiammazione, si attivino nella fase post-prandiale con conseguente compromissione della funzione vascolare.

Parametri in studio:

1. Agenti scatenanti candidati

   • Glicemia postprandiale
   • Iperlipemia postprandiale
   • LDL piccolo denso post-prandiale
   • Insulina postprandiale
   • Meccanismi candidati
   • Attivazione del complemento
   • C3

2. Infiammazione

   • TNF-alfa
   • Interleuchina-6 (IL-6)
   • Interleuchina-10 (IL-10)
   • Proteina C-reattiva (CRP)
   • Stress ossidativo
   • Iso-PGF2-alfa urinario

3. Fenotipi intermedi

   • Spessore intima-media dell'arteria carotidea (IMT) (solo al basale)
   • Funzione endoteliale (vasodilatazione flusso-mediata) (FMD)
   • Rigidità arteriosa (velocità dell'onda del polso) (PWV)

Protocollo sperimentale I soggetti arriveranno presso la Divisione di Endocrinologia e Malattie del Metabolismo dell'Azienda Ospedaliera Comunale di Verona alle ore 08:00 dopo un digiuno notturno. Verranno misurati peso, altezza, circonferenza vita e pressione arteriosa. Durante l'intero studio i soggetti giaceranno a letto in una stanza tranquilla a temperatura controllata (22 °C). Un catetere venoso in teflon verrà inserito in una vena antecubitale per il prelievo di sangue e verrà mantenuto pervio con una normale infusione di soluzione salina a goccia lenta. Lo stato basale sarà considerato raggiunto dopo almeno 20 minuti di riposo a letto dopo la puntura della vena.

I soggetti non devono aver assunto farmaci noti per interferire con la funzione vascolare per almeno 2 settimane e verrà chiesto di astenersi da bevande contenenti caffeina per almeno 24 ore prima dello studio. La pressione arteriosa sistolica, la pressione arteriosa diastolica, la pressione arteriosa media e la frequenza cardiaca saranno monitorate a intervalli di tempo con Cardiocap II (Datex, Finlandia) durante lo studio.

La PWV carotideo-femorale sarà valutata utilizzando Complior (Colson, Garges les Genosse, Francia). L'IMT dell'arteria carotidea sarà valutato mediante ecografia color-doppler ad alta risoluzione. Quindi, la vasodilatazione flusso-mediata endotelio-dipendente dell'arteria femorale comune non dominante sarà valutata mediante eco-doppler ad alta risoluzione (Esaote Biomedica AU6, Genova, Italia), con una sonda vascolare lineare da 10 MHz con risoluzione assiale di 0,01 mm. Il diametro basale e la velocità del flusso sanguigno, un proxy dello sforzo di taglio, saranno valutati almeno in triplicato. Successivamente, un bracciale sfigmomanometrico verrà posizionato sotto il ginocchio e gonfiato 50 mm Hg in più rispetto alla pressione arteriosa sistolica e mantenuto per 5'. Il diametro del vaso e la velocità del flusso saranno misurati al tempo 0,5', 2', 4', 6' e 8' dopo aver sgonfiato il bracciale, secondo il protocollo ben consolidato dei ricercatori. In queste condizioni, quando la cuffia è sgonfia, nei tessuti distali alla cuffia sfigmomanometrica si verificherà iperemia postischemica. Questa iperemia indurrà un aumento della velocità del flusso sanguigno dell'arteria femorale comune, che si trova prossimalmente alla cuffia. L'aumento della velocità del flusso e il conseguente aumento dello sforzo di taglio provocano una vasodilatazione endotelio-dipendente. È stato dimostrato che questa dilatazione è NO-dipendente. Un indice quantitativo globale di vasodilatazione flusso-dipendente sarà ottenuto calcolando l'area sotto la curva di variazione del diametro del vaso in funzione del tempo (8 min di osservazione), espressa sia come valori assoluti che come variazioni percentuali rispetto al diametro del vaso basale . Nelle mani dei ricercatori, il coefficiente di variazione giornaliero di questa tecnica (n=15, che copre un'ampia gamma di risposte vascolari) è del 23,0 ± 3,8%. La vasodilatazione endotelio-indipendente non sarà valutata perché la somministrazione di gliceril-trinitrato a scopo di ricerca è ritenuta eticamente ingiustificabile nei bambini dal Comitato Etico Istituzionale locale.

Nell'esperienza attuale dei ricercatori (n=42 bambini gravemente obesi), l'afta epizootica media dopo un digiuno notturno è di 1,40±0,91% per 8 minuti (media ± SD), lasciando così spazio sostanziale per mostrare cambiamenti dinamici. In questi bambini gravemente obesi questi ricercatori non hanno trovato alcuna correlazione tra afta epizootica e BMI. Un porta sonda US meccanico ad hoc sarà impiegato nei presenti studi accoppiati, con l'obiettivo di aiutare ad aumentare la riproducibilità della tecnica. Inoltre, verrà utilizzata una tecnica specifica di tracciamento automatico del contorno per il calcolo automatico delle variazioni del diametro arterioso per ridurre al minimo la dipendenza dall'operatore di questo metodo.

Saranno raccolti campioni di sangue al basale (-10 min e 0') per misurare glucosio, insulina, peptide C, profilo lipidico standard (colesterolo totale, colesterolo HDL e trigliceridi), LDL ossidato, adiponectina, leptina, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 e CRP mediante micro-metodi per limitare la perdita di sangue. Verrà raccolto un campione separato per misurare le sottofrazioni di LDL e HDL. Le urine basali saranno raccolte per misurare l'iso-PGF2-alfa, un prodotto derivato dalla perossidazione lipidica non enzimatica, catalizzata dai radicali liberi dell'ossigeno sulle membrane cellulari e dalle particelle LDL (43).

Al tempo 0', i soggetti ingeriranno un pasto liquido misto (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) di contenuto calorico noto (300 kcal per m2 di superficie corporea) e composizione (53,8% carboidrati, 29,5% lipidi, 16,7% proteine) oltre 10 minuti. Il glucosio, l'insulina e il peptide C saranno misurati a +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' e +300'. I lipidi standard e il PWV saranno misurati a +60', +120', +180', +240' e +300'. Le sottofrazioni di adiponectina, leptina, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP e LDL e HDL saranno misurate a +180' e +300'. Al tempo +180' verrà ripetuta la valutazione dell'afta epizootica. Al termine del pasto verranno raccolte le urine per valutare l'8-iso-PGF2-alfa.

I campioni di sangue saranno centrifugati velocemente a 1500 g a +4 °C, il plasma/siero sarà raccolto e conservato a -80° C. I campioni di urina saranno conservati a -80° C. La perdita totale di sangue sarà mantenuta sotto i 100 cc.

Metodi analitici Fatta eccezione per la valutazione della sottofrazione LDL/HDL e per la PGF2alfa urinaria, verranno utilizzati metodi specificatamente ottimizzati per l'utilizzo di piccole quantità di plasma/siero per ridurre al minimo la perdita di sangue. Il glucosio sarà misurato al letto del paziente con un analizzatore di glucosio Yellow Spring mediante il metodo della glucosio ossidasi. Il peptide C e l'insulina saranno misurati con micro-metodi ELISA interni. Il colesterolo totale e HDL ei trigliceridi totali saranno valutati mediante micro-metodi enzimatici interni standard. Adiponectina, leptina, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP saranno valutati mediante micro metodi immunometrici interni. L'8-Iso-PGF2alfa sarà valutato mediante saggio immunometrico dopo estrazione dalle urine.

Le sottofrazioni LDL/HDL saranno misurate nel laboratorio del prof. Alberto Zambon, della Facoltà di Medicina dell'Università di Padova. In breve, dopo aver creato un gradiente di densità salina discontinuo in una provetta da ultracentrifuga, i campioni saranno centrifugati a 65.000 rpm per 90 min a 10°C in un rotore verticale Sorvall TV-865B. Trentotto frazioni da 0,45 ml vengono quindi raccolte dal fondo della provetta da centrifuga. Il colesterolo viene misurato in ogni frazione. Il tasso di galleggiamento relativo (Rf), che caratterizza la galleggiabilità del picco di LDL ed è una misura della dimensione/densità delle LDL, si ottiene dividendo il numero della frazione contenente il picco di colesterolo LDL per il numero totale di frazioni raccolte.

Valutazione della funzione delle cellule beta

La funzione delle cellule beta sarà valutata analizzando le curve del glucosio e del peptide C durante il test del pasto misto, secondo la strategia generale proposta da diversi laboratori con alcune leggere modifiche. In breve, la secrezione di insulina è la somma di tre componenti:

1. tassi di secrezione di insulina basale (postassorbimento);
2. secrezione di insulina in risposta alla velocità di aumento del glucosio plasmatico (componente di secrezione "dinamica" o "derivata");
3. secrezione di insulina in risposta ai livelli effettivi di glucosio al di sopra della concentrazione di glucosio dopo l'assorbimento (componente di secrezione "statica" o "proporzionale").

Una descrizione completa della strategia di modellizzazione può essere trovata nelle precedenti pubblicazioni dei ricercatori. I parametri saranno stimati implementando questo modello minimo di secrezione di C-peptide nel SAAM 1.1.2 software (SAAM Institute, Seattle, WA). I valori numerici dei parametri sconosciuti saranno stimati utilizzando i minimi quadrati non lineari.

I pesi sono scelti in modo ottimale, cioè pari all'inverso della varianza degli errori di misurazione, che si presume siano additivi, non correlati, con media zero e un coefficiente di variazione (CV) costante dell'8%.

Questa analisi fornirà lo scenario ormonale in cui si svolgono i processi aterogenetici postprandiali.

Analisi statistica I dati saranno riassunti come medie ± SEM. La dimensione del campione (n=20 in ciascun gruppo) è stata selezionata con l'obiettivo di avere l'80% di possibilità di raggiungere la significatività statistica per differenze del 20-40% (la differenza minima rilevabile varia da variabile a variabile oggetto di studio). La procedura dell'equazione di stima generale (GEE) verrà utilizzata per eseguire l'ANOVA a 2 vie per misure ripetute e per correggere le covariate, se necessario. Verrà testata la distribuzione gaussiana in tutte le variabili e, se si riscontrano deviazioni statisticamente significative dalla normalità, verrà applicata la trasformazione logaritmica (o altro). Le correlazioni saranno ricercate mediante il coefficiente di correlazione per ranghi di Spearman. La significatività statistica sarà dichiarata a p<0.05. Le analisi statistiche verranno eseguite utilizzando SPSS 12.0 (o superiore) per MacOS X.

Il raggiungimento degli obiettivi del presente progetto di ricerca:

1. ampliare le conoscenze sulla relazione tra obesità infantile, infiammazione, insulino-resistenza e disfunzione vascolare;
2. chiarire se l'iperlipemia postprandiale, l'infiammazione postprandiale e/o lo stress ossidativo postprandiale sono associati a fenotipi intermedi di aterosclerosi nel bambino/adolescente obeso;
3. stabilire potenziali nuovi obiettivi di prevenzione delle complicanze dell'obesità nel bambino/adolescente e potenzialmente indicare nuovi strumenti per il trattamento dei disturbi associati all'obesità.