Mechanizmy aterogenezy w okresie poposiłkowym w otyłości dziecięcej

Niektóre z wcześniejszych zarysów zależności między powiększoną masą tłuszczową a insulinoopornością nie zostały udowodnione eksperymentalnie na człowieku. Na przykład większość związków wykazanych u ludzi między cytokinami a wrażliwością na insulinę to obserwacje korelacyjne.

U otyłych dzieci stłuszczenie wątroby jest dość powszechne i jest ściślej niż inne magazyny tłuszczu związane z opornością na insulinę, dyslipidemią, wysokim ciśnieniem krwi i wysokimi poziomami markerów stanu zapalnego. Cały obraz jest zatem zgodny z przyspieszonym dążeniem do miażdżycy u otyłych dzieci/młodzieży. Rzeczywiście, kilka doniesień wykazało, że u otyłych dzieci można wykryć pośrednie fenotypy miażdżycy. Ponadto uważa się, że faza poposiłkowa odgrywa własną rolę w aterogenezie.

Badacze wysuwają hipotezę, że u otyłych dzieci z insulinoopornością mechanizmy aterogenezy, takie jak hiperlipemia, stres oksydacyjny i stany podzapalne, aktywują się w fazie poposiłkowej, powodując upośledzenie funkcji naczyń.

Badane parametry:

1. Kandydaci na czynniki wyzwalające

   • Glukoza poposiłkowa
   • Hiperlipemia poposiłkowa
   • Poposiłkowy mały gęsty LDL
   • Insulina poposiłkowa
   • Mechanizmy kandydatów
   • Aktywacja dopełniacza
   • C3

2. Zapalenie

   • TNF-alfa
   • Interleukina-6 (IL-6)
   • Interleukina-10 (IL-10)
   • Białko C-reaktywne (CRP)
   • Stres oksydacyjny
   • Mocz izo-PGF2-alfa

3. Fenotypy pośrednie

   • Grubość błony wewnętrznej i środkowej tętnicy szyjnej (IMT) (tylko na początku badania)
   • Funkcja śródbłonka (rozszerzenie naczyń zależne od przepływu) (FMD)
   • Sztywność tętnic (prędkość fali tętna) (PWV)

Protokół eksperymentu Pacjenci przybywają na Oddział Endokrynologii i Chorób Metabolicznych Szpitala Miejskiego w Weronie o godzinie 08:00 po całonocnym poście. Zostanie zmierzona waga, wzrost, obwód talii i ciśnienie krwi. Podczas całego badania badani będą leżeć w łóżku w cichym pokoju z kontrolowaną temperaturą (22°C). Teflonowy cewnik żylny zostanie wprowadzony do żyły przedłokciowej w celu pobrania krwi i będzie utrzymywany w stanie drożnym przy powolnym wlewie z normalnej soli fizjologicznej. Stan wyjściowy zostanie uznany za osiągnięty po co najmniej 20 minutach odpoczynku w łóżku po nakłuciu żyły.

Osoby badane nie mogły przyjmować żadnych leków, o których wiadomo, że zakłócają czynność naczyń przez co najmniej 2 tygodnie i zostaną poproszone o powstrzymanie się od napojów zawierających kofeinę przez co najmniej 24 godziny przed badaniem. Skurczowe ciśnienie krwi, rozkurczowe ciśnienie krwi, średnie ciśnienie tętnicze i częstość akcji serca będą monitorowane w odstępach czasowych za pomocą Cardiocap II (Datex, Finlandia) przez cały okres badania.

PWV tętnicy szyjnej i udowej zostanie ocenione za pomocą Complior (Colson, Garges les Genosse, Francja). IMT tętnicy szyjnej zostanie ocenione za pomocą kolorowego dopplera USG o wysokiej rozdzielczości. Następnie zależne od przepływu rozszerzenie naczyń śródbłonka niedominującej wspólnej tętnicy udowej zostanie ocenione za pomocą echodopplera o wysokiej rozdzielczości (Esaote Biomedica AU6, Genova, Włochy) z liniową sondą naczyniową 10 MHz z rozdzielczością osiową 0,01 mm. Średnicę wyjściową i prędkość przepływu krwi, przybliżenie naprężenia ścinającego, ocenia się co najmniej w trzech powtórzeniach. Następnie mankiet sfigmomanometryczny zostanie umieszczony pod kolanem i napompowany o 50 mm Hg powyżej skurczowego ciśnienia krwi i utrzymany przez 5 minut. Średnica naczynia i prędkość przepływu będą mierzone w czasie 0,5', 2', 4', 6' i 8' po opróżnieniu mankietu, zgodnie z ustalonym protokołem badaczy. W tych warunkach, gdy mankiet zostanie opróżniony, w tkankach znajdujących się dystalnie od mankietu sfigmomanometrycznego wystąpi przekrwienie po niedokrwieniu. To przekrwienie wywoła wzrost prędkości przepływu krwi w tętnicy udowej wspólnej, która znajduje się proksymalnie do mankietu. Wzrost prędkości przepływu i wynikający z tego wzrost naprężenia ścinającego wywołuje zależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń. Wykazano, że dylatacja ta jest zależna od NO. Globalny wskaźnik ilościowy zależnego od przepływu rozszerzenia naczyń zostanie uzyskany poprzez obliczenie pola pod krzywą zmiany średnicy naczynia w funkcji czasu (8 min obserwacji), wyrażonego zarówno jako wartości bezwzględne, jak i procentowe zmiany w stosunku do wyjściowej średnicy naczynia . W rękach badaczy, międzydniowy współczynnik zmienności tej techniki (n=15, obejmujący szeroki zakres odpowiedzi naczyniowej) wynosi 23,0 ± 3,8%. Niezależne od śródbłonka rozszerzenie naczyń nie będzie oceniane, ponieważ podawanie trójazotanu glicerolu w celach badawczych zostało uznane przez lokalną Instytucjonalną Komisję Etyczną za etycznie nieuzasadnione u dzieci.

Z dotychczasowych doświadczeń badaczy (n=42 poważnie otyłych dzieci) wynika, że ​​średnia FMD po całonocnym poście wynosi 1,40 ± 0,91%. na 8 minut (średnia ± SD), pozostawiając w ten sposób znaczną przestrzeń do pokazania dynamicznych zmian. U tych poważnie otyłych dzieci badacze nie stwierdzili korelacji między FMD a BMI. Mechaniczny uchwyt sondy US ad hoc zostanie wykorzystany w obecnych badaniach sparowanych, aby pomóc w zwiększeniu odtwarzalności techniki. Ponadto zostanie zastosowana specyficzna technika automatycznego śledzenia konturów do automatycznego obliczania zmian średnicy tętnicy, aby zminimalizować zależność tej metody od operatora.

Wyjściowe (-10 min i 0') zostaną pobrane próbki krwi w celu pomiaru glukozy, insuliny, peptydu C, standardowego profilu lipidowego (cholesterolu całkowitego, cholesterolu HDL i triglicerydów), utlenionego LDL, adiponektyny, leptyny, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 i CRP mikrometodami w celu ograniczenia utraty krwi. Oddzielna próbka zostanie pobrana do pomiaru podfrakcji LDL i HDL. Wyjściowe próbki moczu zostaną zebrane w celu oznaczenia izo-PGF2-alfa, produktu pochodzącego z nieenzymatycznej peroksydacji lipidów, katalizowanej przez wolne rodniki tlenowe na błonach komórkowych i cząsteczki LDL (43).

W czasie 0' badani spożyją zmieszany płynny posiłek (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) o znanej zawartości kalorii (300 kcal na m2 powierzchni ciała) i składzie (53,8% węglowodanów, 29,5% lipidów, 16,7% białek) ponad 10 minut. Glukoza, insulina i peptyd C będą mierzone w temperaturze +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' i +300'. Standardowe lipidy i PWV będą mierzone przy +60', +120', +180', +240' i +300'. Adiponektyna, leptyna, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP oraz podfrakcje LDL i HDL będą mierzone przy +180' i +300'. W czasie +180' ocena FMD zostanie powtórzona. Na koniec posiłku zostaną pobrane próbki moczu w celu oceny 8-izo-PGF2-alfa.

Próbki krwi zostaną szybko odwirowane przy 1500 gw temperaturze +4°C, pobrane osocze/surowica i przechowywane w temperaturze -80°C. Próbki moczu będą przechowywane w temperaturze -80°C. Całkowita utrata krwi będzie utrzymywana poniżej 100 cm3.

Metody analityczne Z wyjątkiem oceny podfrakcji LDL/HDL i PGF2alfa w moczu, w celu zminimalizowania utraty krwi zostaną użyte metody specjalnie zoptymalizowane pod kątem wykorzystania niewielkich ilości osocza/surowicy. Poziom glukozy będzie mierzony przy łóżku pacjenta za pomocą analizatora glukozy Yellow Spring metodą oksydazy glukozy. Peptyd C i insulina będą mierzone za pomocą wewnętrznych mikrometod ELISA. Cholesterol całkowity i HDL oraz triglicerydy całkowite zostaną ocenione standardowymi, wewnętrznymi mikrometodami enzymatycznymi. Adiponektyna, leptyna, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP będą oznaczane autorskimi mikrometodami immunometrycznymi. 8-Iso-PGF2alfa zostanie oceniony w teście immunometrycznym po ekstrakcji z moczu.

Subfrakcje LDL/HDL będą mierzone w laboratorium prof. Alberto Zambon z Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu w Padwie. W skrócie, po utworzeniu nieciągłego gradientu gęstości soli w probówce ultrawirówki, próbki będą wirowane przy 65 000 obr./min przez 90 min w 10°C w pionowym rotorze Sorvall TV-865B. Następnie z dna probówki wirówkowej zbiera się trzydzieści osiem frakcji o objętości 0,45 ml. Cholesterol jest mierzony w każdej frakcji. Względny współczynnik flotacji (Rf), który charakteryzuje wyporność piku LDL i jest miarą wielkości/gęstości LDL, otrzymuje się przez podzielenie liczby frakcji zawierającej pik cholesterolu LDL przez całkowitą liczbę zebranych frakcji.

Ocena funkcji komórek beta

Czynność komórek beta zostanie oceniona poprzez analizę krzywych glukozy i peptydu C podczas testu z mieszanym posiłkiem, zgodnie z ogólną strategią zaproponowaną przez kilka laboratoriów z niewielkimi modyfikacjami. Krótko mówiąc, wydzielanie insuliny jest sumą trzech składników:

1. podstawowe (poabsorpcyjne) wskaźniki wydzielania insuliny;
2. wydzielanie insuliny w odpowiedzi na szybkość wzrostu glukozy w osoczu („dynamiczny” lub „pochodny” składnik wydzielania);
3. wydzielanie insuliny w odpowiedzi na rzeczywisty poziom glukozy powyżej stężenia glukozy poabsorpcyjnej (składnik wydzielania „statyczny” lub „proporcjonalny”).

Pełny opis strategii modelowania można znaleźć we wcześniejszych publikacjach badaczy. Parametry zostaną oszacowane poprzez wdrożenie tego minimalnego modelu wydzielania peptydu C w SAAM 1.1.2 oprogramowanie (SAAM Institute, Seattle, WA). Wartości liczbowe nieznanych parametrów zostaną oszacowane przy użyciu nieliniowej metody najmniejszych kwadratów.

Wagi są dobierane optymalnie, tj. równe odwrotności wariancji błędów pomiaru, które zakłada się, że są addytywne, nieskorelowane, ze średnią zerową i stałym współczynnikiem zmienności (CV) równym 8%.

Ta analiza dostarczy scenariusza hormonalnego, w którym zachodzą poposiłkowe procesy miażdżycowe.

Analiza statystyczna Dane zostaną podsumowane jako średnie ± SEM. Wielkość próby (n=20 w każdej grupie) została dobrana tak, aby mieć 80% szans na osiągnięcie istotności statystycznej dla różnic 20-40% (minimalna wykrywalna różnica różni się w zależności od badanej zmiennej). Ogólna procedura równania szacowania (GEE) zostanie wykorzystana do przeprowadzenia dwukierunkowej analizy ANOVA dla powtarzanych pomiarów iw razie potrzeby dostosowania do współzmiennych. Rozkład Gaussa zostanie przetestowany dla wszystkich zmiennych, aw przypadku stwierdzenia istotnych statystycznie odchyleń od normalności zostanie zastosowana transformacja logarytmiczna (lub inna). Korelacje będą poszukiwane za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana. Istotność statystyczna zostanie zadeklarowana przy p<0,05. Analizy statystyczne zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania SPSS 12.0 (lub nowszego) dla systemu MacOS X.

Osiągnięcie celów niniejszego projektu badawczego spowoduje:

1. poszerzyć wiedzę na temat związku otyłości u dzieci ze stanami zapalnymi, insulinoopornością i dysfunkcjami naczyniowymi;
2. wyjaśnić, czy poposiłkowa hiperlipemia, poposiłkowy stan zapalny i/lub poposiłkowy stres oksydacyjny są związane z pośrednimi fenotypami miażdżycy u otyłych dzieci/młodzieży;
3. ustalić potencjalne nowe cele profilaktyki powikłań otyłości u dzieci/młodzieży i potencjalnie wskazać nowe narzędzia do leczenia zaburzeń związanych z otyłością.