Mécanismes de l'athérogenèse pendant la période post-prandiale dans l'obésité infantile

Certaines des premières esquisses des relations entre l'augmentation de la masse grasse et la résistance à l'insuline n'ont pas été prouvées expérimentalement chez l'homme. Par exemple, la plupart des relations montrées chez l'homme entre les cytokines et la sensibilité à l'insuline sont des observations corrélationnelles.

Chez l'enfant obèse, la stéatose hépatique est assez répandue et est plus étroitement associée que d'autres dépôts de graisse à la résistance à l'insuline, à la dyslipidémie, à l'hypertension artérielle et à des niveaux élevés de marqueurs d'inflammation. L'ensemble du tableau est donc cohérent avec une poussée accélérée vers l'athérosclérose chez l'enfant/adolescent obèse. En effet, plusieurs rapports ont démontré que des phénotypes intermédiaires d'athérosclérose peuvent être détectés chez l'enfant obèse. De plus, la phase post-prandiale jouerait un rôle propre dans l'athérogenèse.

Les chercheurs émettent l'hypothèse que chez l'enfant obèse résistant à l'insuline, les mécanismes de l'athérogenèse, tels que l'hyperlipémie, le stress oxydant et la sous-inflammation, sont activés dans la phase post-prandiale entraînant des altérations de la fonction vasculaire.

Paramètres à l'étude :

1. Agents déclencheurs candidats

   • Glycémie post-prandiale
   • Hyperlipémie post-prandiale
   • Petits LDL denses post-prandiaux
   • Insuline post-prandiale
   • Mécanismes candidats
   • Activation du complément
   • C3

2. Inflammation

   • TNF-alpha
   • Interleukine-6 ​​(IL-6)
   • Interleukine-10 (IL-10)
   • Protéine C-réactive (CRP)
   • Stress oxydant
   • Iso-PGF2-alpha urinaire

3. Phénotypes intermédiaires

   • Épaisseur intima-média (IMT) de l'artère carotide (uniquement au départ)
   • Fonction endothéliale (vasodilatation médiée par le flux) (FMD)
   • Rigidité artérielle (vitesse des ondes de pouls) (PWV)

Protocole expérimental Les sujets arriveront à la Division d'Endocrinologie et des Maladies Métaboliques de l'Hôpital de la Ville de Vérone à 08h00 après une nuit de jeûne. Le poids, la taille, le tour de taille et la tension artérielle seront mesurés. Pendant toute la durée de l'étude, les sujets seront allongés dans un lit dans une pièce calme à température contrôlée (22 °C). Un cathéter veineux en téflon sera inséré dans une veine antécubitale pour le prélèvement sanguin et sera maintenu perméable avec une perfusion lente de solution saline normale. L'état de base sera considéré comme atteint après au moins 20 minutes de repos au lit après la ponction veineuse.

Les sujets ne doivent avoir pris aucun médicament connu pour interférer avec la fonction vasculaire pendant au moins 2 semaines et il leur sera demandé de s'abstenir de boissons contenant de la caféine pendant au moins 24 heures avant l'étude. La pression artérielle systolique, la pression artérielle diastolique, la pression artérielle moyenne et la fréquence cardiaque seront surveillées à intervalles réguliers avec Cardiocap II (Datex, Finlande) tout au long de l'étude.

La VOP carotido-fémorale sera évaluée à l'aide de Complior (Colson, Garges les Genosse, France) . L'IMT de l'artère carotide sera évaluée par un balayage Doppler couleur US à haute résolution. Ensuite, la vasodilatation dépendante de l'endothélium médiée par le flux de l'artère fémorale commune non dominante sera évaluée par écho-doppler haute résolution (Esaote Biomedica AU6, Gênes, Italie), avec une sonde vasculaire linéaire de 10 MHz avec une résolution axiale de 0,01 mm. Le diamètre de base et la vitesse du flux sanguin, un indicateur de la contrainte de cisaillement, seront évalués au moins en trois exemplaires. Après cela, un brassard sphygmomanométrique sera placé sous le genou et gonflé à 50 mm Hg de plus que la pression artérielle systolique et maintenu pendant 5'. Le diamètre du vaisseau et la vitesse d'écoulement seront mesurés au temps 0,5', 2', 4', 6' et 8' après le dégonflage du brassard, selon le protocole bien établi des investigateurs . Dans ces conditions, lorsque le ballonnet est dégonflé, une hyperémie post-ischémique se produira dans les tissus qui sont distaux au ballonnet sphygmomanométrique. Cette hyperémie va induire une augmentation de la vitesse du flux sanguin de l'artère fémorale commune, qui est située en amont de la manchette. L'augmentation de la vitesse d'écoulement et l'augmentation de la contrainte de cisaillement qui en résulte provoquent une vasodilatation dépendante de l'endothélium. Il a été montré que cette dilatation est NO-dépendante. Un indice quantitatif global de vasodilatation dépendant du débit sera obtenu en calculant l'aire sous la courbe de changement du diamètre du vaisseau en fonction du temps (8 min d'observation), exprimée à la fois en valeurs absolues et en pourcentage de changement par rapport au diamètre du vaisseau de référence . Entre les mains des investigateurs, le coefficient de variation entre les jours de cette technique (n = 15, couvrant une large gamme de réponses vasculaires) est de 23,0 ± 3,8 %. La vasodilatation indépendante de l'endothélium ne sera pas évaluée car l'administration de trinitrate de glycéryle à des fins de recherche est jugée éthiquement injustifiable chez les enfants par le comité d'éthique institutionnel local.

Dans l'expérience actuelle des enquêteurs (n = 42 enfants gravement obèses), la fièvre aphteuse moyenne après un jeûne nocturne est de 1,40 ± 0,91 % par 8 minutes (moyenne ± SD), laissant ainsi une marge substantielle pour montrer les changements dynamiques. Chez ces enfants gravement obèses, ces chercheurs n'ont trouvé aucune corrélation entre la fièvre aphteuse et l'IMC. Un support de sonde US mécanique ad hoc sera utilisé dans les présentes études appariées, dans le but d'aider à augmenter la reproductibilité de la technique. De plus, une technique spécifique de suivi automatique des contours pour le calcul automatique des changements de diamètre artériel sera utilisée pour minimiser la dépendance à l'opérateur de cette méthode.

Des échantillons de sang de base (-10 min et 0 ') seront prélevés pour mesurer le glucose, l'insuline, le peptide C, le profil lipidique standard (cholestérol total, cholestérol HDL et triglycérides), le LDL oxydé, l'adiponectine, la leptine, C3, TNF -alpha, IL-6, IL-10 et CRP par des micro-méthodes pour limiter les pertes sanguines. Un échantillon séparé sera prélevé pour mesurer les sous-fractions LDL et HDL. Les urines de base seront recueillies pour mesurer l'iso-PGF2-alpha, un produit dérivé de la peroxydation lipidique non enzymatique, catalysée par les radicaux libres d'oxygène sur les membranes cellulaires et les particules de LDL (43).

Au temps 0', les sujets ingèrent un repas liquide mixte (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) de teneur calorique connue (300 kcal par m2 de surface corporelle) et de composition (53,8 % de glucides, 29,5 % de lipides, 16,7 % de protéines) plus de 10 minutes. Le glucose, l'insuline et le peptide C seront mesurés à +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' et +300'. Les lipides standards et le PWV seront mesurés à +60', +120', +180', +240' et +300'. Les sous-fractions adiponectine, leptine, C3, TNF-alpha, IL-6, IL-10, CRP et LDL et HDL seront mesurées à +180' et +300'. Au temps +180', l'évaluation de la fièvre aphteuse sera répétée. A la fin du repas test les urines seront prélevées pour évaluer la 8-iso-PGF2-alpha.

Les échantillons de sang seront centrifugés rapidement à 1 500 g à +4 °C, le plasma/sérum sera prélevé et conservé à -80 °C. Les échantillons d'urine seront conservés à -80 °C. La perte de sang totale sera maintenue en dessous de 100 cc.

Méthodes analytiques À l'exception de l'évaluation des sous-fractions LDL/HDL et de la PGF2alpha urinaire, des méthodes spécifiquement optimisées pour utiliser de petites quantités de plasma/sérum seront utilisées pour minimiser la perte de sang. Le glucose sera mesuré au chevet du patient avec un analyseur de glucose Yellow Spring par la méthode de la glucose oxydase. Le peptide C et l'insuline seront mesurés par des micro-méthodes ELISA internes. Le cholestérol total et HDL et les triglycérides totaux seront évalués par des micro-méthodes enzymatiques internes standard. Adiponectine, leptine, C3, TNF-alpha, IL-6, IL-10, CRP seront évalués par des méthodes micro immunométriques internes. La 8-Iso-PGF2alpha sera évaluée par un dosage immunométrique après extraction des urines.

Les sous-fractions LDL/HDL seront mesurées dans le laboratoire du prof. Alberto Zambon, à l'École de médecine de l'Université de Padoue. Brièvement, après avoir créé un gradient discontinu de densité de sel dans un tube d'ultracentrifugeuse, les échantillons seront centrifugés à 65 000 tr/min pendant 90 min à 10°C dans un rotor vertical Sorvall TV-865B. Trente-huit fractions de 0,45 ml sont ensuite recueillies au fond du tube de centrifugation. Le cholestérol est mesuré dans chaque fraction. Le taux de flottation relatif (Rf), qui caractérise la flottabilité maximale des LDL et est une mesure de la taille/densité des LDL, est obtenu en divisant le nombre de fractions contenant le pic de cholestérol LDL par le nombre total de fractions collectées.

Évaluation de la fonction des cellules bêta

La fonction des cellules bêta sera évaluée en analysant les courbes de glucose et de peptide C lors du test du repas mixte, selon la stratégie générale proposée par plusieurs laboratoires avec quelques légères modifications. En bref, la sécrétion d'insuline est la somme de trois composants :

1. les taux de sécrétion d'insuline basale (postabsorptive);
2. la sécrétion d'insuline en réponse au taux d'augmentation du glucose plasmatique (composant de sécrétion "dynamique" ou "dérivé");
3. la sécrétion d'insuline en réponse aux niveaux de glucose réels au-dessus de la concentration de glucose post-absorption (composante de sécrétion "statique" ou "proportionnelle").

Une description complète de la stratégie de modélisation peut être trouvée dans les publications antérieures des chercheurs. Les paramètres seront estimés en mettant en œuvre ce modèle minimal de sécrétion de peptide C dans le SAAM 1.1.2 logiciel (SAAM Institute, Seattle, WA). Les valeurs numériques des paramètres inconnus seront estimées en utilisant les moindres carrés non linéaires.

Les poids sont choisis de manière optimale, c'est-à-dire égaux à l'inverse de la variance des erreurs de mesure, qui sont supposées additives, non corrélées, de moyenne nulle et de coefficient de variation (CV) constant de 8 %.

Cette analyse fournira le scénario hormonal dans lequel se déroulent les processus athérogènes postprandiaux.

Analyse statistique Les données seront résumées sous forme de moyennes ± SEM. La taille de l'échantillon (n = 20 dans chaque groupe) a été sélectionnée dans le but d'avoir 80 % de chances d'atteindre une signification statistique pour des différences de 20 à 40 % (la différence minimale détectable varie d'une variable à l'autre à l'étude). La procédure d'équation d'estimation générale (GEE) sera utilisée pour exécuter une ANOVA à 2 facteurs pour des mesures répétées et pour ajuster les covariables, si nécessaire. La distribution gaussienne sera testée dans toutes les variables et, si des écarts statistiquement significatifs par rapport à la normalité sont trouvés, une transformation logarithmique (ou autre) sera appliquée. Les corrélations seront recherchées par le coefficient de corrélation de rang de Spearman. La signification statistique sera déclarée à p<0,05. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide de SPSS 12.0 (ou supérieur) pour MacOS X.

Atteindre les objectifs du présent projet de recherche permettra :

1. élargir les connaissances sur la relation entre l'obésité infantile, l'inflammation, la résistance à l'insuline et le dysfonctionnement vasculaire ;
2. élucider si l'hyperlipémie postprandiale, l'inflammation postprandiale et/ou le stress oxydant postprandial sont associés à des phénotypes intermédiaires d'athérosclérose chez l'enfant/adolescent obèse ;
3. établir de nouvelles cibles potentielles de prévention des complications de l'obésité chez l'enfant/adolescent et éventuellement indiquer de nouveaux outils pour le traitement des troubles associés à l'obésité.