Mechanismen van atherogenese tijdens de postprandiale tijd bij obesitas bij kinderen

Sommige eerdere schetsen van de relaties tussen vergrote vetmassa en insulineresistentie zijn niet experimenteel bewezen bij de mens. De meeste relaties die bij mensen worden aangetoond tussen cytokines en insulinegevoeligheid zijn bijvoorbeeld correlationele waarnemingen.

Bij het zwaarlijvige kind komt leververvetting vrij veel voor en is nauwer dan andere vetdepots geassocieerd met insulineresistentie, dyslipidemie, hoge bloeddruk en hoge niveaus van ontstekingsmarkers. Het hele plaatje komt daarom overeen met een versnelde drang naar atherosclerose bij het zwaarlijvige kind/de adolescent. Verschillende rapporten hebben inderdaad aangetoond dat intermediaire fenotypes van atherosclerose kunnen worden gedetecteerd bij het zwaarlijvige kind. Bovendien wordt aangenomen dat de postprandiale fase op zichzelf een rol speelt bij atherogenese.

De onderzoekers veronderstellen dat bij het obese insulineresistente kind mechanismen van atherogenese, zoals hyperlipemie, oxidatieve stress en subontsteking, worden geactiveerd in de postprandiale fase, wat resulteert in stoornissen van de vasculaire functie.

Parameters die worden bestudeerd:

1. Kandidaat triggering agenten

   • Postprandiale glucose
   • Postprandiale hyperlipemie
   • Postprandiaal klein dicht LDL
   • Postprandiale insuline
   • Kandidaat-mechanismen
   • Complementaire activatie
   • C3

2. Ontsteking

   • TNF-alfa
   • Interleukine-6 ​​(IL-6)
   • Interleukine-10 (IL-10)
   • C-reactief proteïne (CRP)
   • Oxiderende stress
   • Urinair iso-PGF2-alfa

3. Tussenliggende fenotypes

   • Halsslagader intima-media dikte (IMT) (alleen bij baseline)
   • Endotheliale functie (flow-gemedieerde vasodilatatie) (MKZ)
   • Arteriële stijfheid (pulsgolfsnelheid) (PWV)

Experimenteel protocol De proefpersonen zullen na een nacht vasten om 08.00 uur aankomen bij de afdeling Endocrinologie en Metabole Ziekten van het Verona City Hospital. Gewicht, lengte, tailleomtrek en bloeddruk worden gemeten. Gedurende het hele onderzoek liggen de proefpersonen in bed in een stille, temperatuur gecontroleerde (22 °C) kamer. Een teflon veneuze katheter zal in een antecubitale ader worden ingebracht voor bloedafname en zal patent worden gehouden met een normale langzaam druppelende infusie met zoutoplossing. De uitgangstoestand wordt geacht te zijn bereikt na ten minste 20 minuten rust in bed na aderpunctie.

De proefpersonen mogen gedurende ten minste 2 weken geen medicijnen hebben gebruikt waarvan bekend is dat ze de vasculaire functie verstoren en er wordt hen gevraagd om gedurende ten minste 24 uur vóór het onderzoek af te zien van cafeïnehoudende dranken. De systolische bloeddruk, de diastolische bloeddruk, de gemiddelde arteriële druk en de hartslag zullen tijdens het onderzoek op tijdsintervallen worden gecontroleerd met Cardiocap II (Datex, Finland).

Carotis-femorale PWV zal worden beoordeeld met behulp van Complior (Colson, Garges les Genosse, Frankrijk). De IMT van de halsslagader zal worden beoordeeld door middel van een hoge resolutie US kleuren-dopplerscan. Vervolgens zal door stroming gemedieerde endotheelafhankelijke vasodilatatie van de niet-dominante arteria femoralis worden beoordeeld door middel van echo-doppler met hoge resolutie (Esaote Biomedica AU6, Genova, Italië), met een 10 MHz lineaire vasculaire sonde met een axiale resolutie van 0,01 mm. Basislijndiameter en bloedstroomsnelheid, een proxy van schuifspanning, zullen ten minste in drievoud worden beoordeeld. Hierna wordt een sfygmomanometrische manchet onder de knie geplaatst en 50 mm Hg hoger dan de systolische bloeddruk opgeblazen en gedurende 5 minuten vastgehouden. De diameter van het vat en de stroomsnelheid worden gemeten op tijdstip 0,5', 2', 4', 6' en 8' na het leeglopen van de manchet, volgens het gevestigde protocol van de onderzoekers. Onder deze omstandigheden zal, wanneer de manchet leegloopt, post-ischemische hyperemie plaatsvinden in de weefsels die zich distaal van de sfygmomanometrische manchet bevinden. Deze hyperemie veroorzaakt een toename van de bloedstroomsnelheid van de gemeenschappelijke dijbeenslagader, die zich proximaal van de manchet bevindt. De toename van de stroomsnelheid en de daaruit voortvloeiende toename van de schuifspanning veroorzaken een endotheelafhankelijke vasodilatatie. Het is aangetoond dat deze dilatatie NO-afhankelijk is. Een globale kwantitatieve index van stromingsafhankelijke vasodilatatie zal worden verkregen door het gebied onder de kromme van verandering in bloedvatdiameter te berekenen als functie van de tijd (8 min observatie), zowel uitgedrukt als absolute waarden als als procentuele veranderingen ten opzichte van de basisvatdiameter . In de handen van onderzoekers is de variatiecoëfficiënt van deze techniek tussen de dagen (n=15, die een breed bereik van vasculaire respons dekt) 23,0 ± 3,8%. Endotheelonafhankelijke vasodilatatie zal niet worden geëvalueerd omdat toediening van glyceryltrinitraat voor onderzoeksdoeleinden ethisch niet te rechtvaardigen is bij kinderen door de lokale Institutionele Ethische Commissie.

Volgens de huidige ervaring van onderzoekers (n=42 ernstig zwaarlijvige kinderen) is de gemiddelde MKZ na een nacht vasten 1,40 ± 0,91% per 8 minuten (gemiddelde ± SD), waardoor er veel ruimte overblijft om dynamische veranderingen te laten zien. Bij deze ernstig zwaarlijvige kinderen vonden deze onderzoekers geen correlatie tussen FMD en BMI. Een ad hoc mechanische Amerikaanse sondehouder zal worden gebruikt in de huidige gepaarde studies, met als doel de reproduceerbaarheid van de techniek te vergroten. Bovendien zal een specifieke automatische contourvolgtechniek voor de automatische berekening van de veranderingen in arteriële diameter worden gebruikt om de afhankelijkheid van de operator van deze methode te minimaliseren.

Baseline (-10 min en 0') bloedmonsters zullen worden verzameld om glucose, insuline, C-peptide, standaard lipidenprofiel (totaal cholesterol, HDL-cholesterol en triglyceriden), geoxideerd LDL, adiponectine, leptine, C3, TNF te meten -alpha, IL-6, IL-10 en CRP door micro-methoden om bloedverlies te beperken. Er wordt een afzonderlijk monster verzameld om LDL- en HDL-subfracties te meten. Baseline-urines zullen worden verzameld om iso-PGF2-alfa te meten, een product afgeleid van niet-enzymatische lipideperoxidatie, gekatalyseerd door zuurstofvrije radicalen op celmembranen en LDL-deeltjes (43).

Op tijd 0' krijgen proefpersonen een gemengde vloeibare maaltijd (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) met bekende calorische inhoud (300 kcal per m2 lichaamsoppervlak) en samenstelling (53,8% koolhydraten, 29,5% lipiden, 16,7% eiwitten) meer dan 10 minuten. Glucose, insuline en C-peptide worden gemeten bij +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' en +300'. Standaardlipiden en PWV worden gemeten bij +60', +120', +180', +240' en +300'. Adiponectine-, leptine-, C3-, TNF-alfa-, IL-6-, IL-10-, CRP- en LDL- en HDL-subfracties worden gemeten op +180' en +300'. Op tijd +180' zal de beoordeling van FMD worden herhaald. Aan het einde van de maaltijd worden testurine verzameld om 8-iso-PGF2-alfa te beoordelen.

Bloedmonsters worden snel gecentrifugeerd bij 1500 g bij +4 °C, plasma/serum wordt verzameld en bewaard bij -80 °C. Urinemonsters worden bewaard bij -80 °C. Het totale bloedverlies wordt onder de 100 cc gehouden.

Analytische methoden Met uitzondering van LDL/HDL-subfractiebepaling en urine PGF2alpha, zullen methoden die specifiek zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van kleine hoeveelheden plasma/serum worden gebruikt om bloedverlies tot een minimum te beperken. Glucose wordt aan het bed gemeten met een Yellow Spring Glucose Analyzer volgens de glucose-oxidasemethode. C-peptide en insuline zullen worden gemeten met interne ELISA-micromethoden. Totaal- en HDL-cholesterol en totaal triglyceriden zullen worden beoordeeld met standaard interne enzymatische micromethoden. Adiponectine, leptine, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP zullen worden beoordeeld met interne immunometrische micromethoden. 8-Iso-PGF2alpha zal worden beoordeeld door middel van een immunometrische test na extractie uit urine.

LDL/HDL subfracties worden gemeten in het laboratorium van prof. Alberto Zambon, aan de Universiteit van Padua School of Medicine. In het kort, na het creëren van een discontinue zoutdichtheidsgradiënt in een ultracentrifugebuis, worden de monsters gecentrifugeerd bij 65.000 rpm gedurende 90 minuten bij 10°C in een Sorvall TV-865B verticale rotor. Vervolgens worden achtendertig fracties van 0,45 ml verzameld op de bodem van de centrifugebuis. In elke fractie wordt cholesterol gemeten. De relatieve flotatiesnelheid (Rf), die het LDL-piekdrijfvermogen kenmerkt en een maat is voor de LDL-grootte/dichtheid, wordt verkregen door het aantal fracties dat de LDL-cholesterolpiek bevat, te delen door het totale aantal verzamelde fracties.

Beoordeling van de bètacelfunctie

De bètacelfunctie zal geëvalueerd worden door analyse van de glucose- en C-peptidecurven tijdens de gemengde maaltijdtest, volgens de algemene strategie voorgesteld door verschillende laboratoria met enkele kleine aanpassingen. In het kort is insulinesecretie de som van drie componenten:

1. basale (postabsorptieve) insulinesecretiesnelheden;
2. insulinesecretie als reactie op de toenamesnelheid van plasmaglucose ("dynamische" of "afgeleide" secretiecomponent);
3. insulinesecretie als reactie op de werkelijke glucosespiegels boven de post-absorptieve glucoseconcentratie ("statische" of "proportionele" secretiecomponent).

Een volledige beschrijving van de modelleringsstrategie is te vinden in eerdere publicaties van de onderzoekers. Parameters zullen geschat worden door dit minimale model van C-peptide secretie te implementeren in de SAAM 1.1.2 software (SAAM Instituut, Seattle, WA). Numerieke waarden van de onbekende parameters zullen worden geschat met behulp van niet-lineaire kleinste kwadraten.

Gewichten worden optimaal gekozen, d.w.z. gelijk aan de inverse van de variantie van de meetfouten, waarvan wordt aangenomen dat ze additief zijn, niet gecorreleerd, met een gemiddelde van nul en een constante variatiecoëfficiënt (CV) van 8%.

Deze analyse zal het hormonale scenario opleveren waarin de postprandiale atherogenetische processen plaatsvinden.

Statistische analyse Gegevens zullen worden samengevat als gemiddelden ± SEM. De grootte van de steekproef (n=20 in elke groep) is gekozen met als doel 80% kans te hebben op het bereiken van statistische significantie voor verschillen van 20-40% (het minimaal detecteerbare verschil varieert van variabele tot variabele die wordt bestudeerd). De algemene schattingsvergelijkingsprocedure (GEE) zal worden gebruikt om 2-weg ANOVA uit te voeren voor herhaalde metingen en om, indien nodig, aan te passen voor covariaten. De Gaussiaanse verdeling zal worden getest in alle variabelen, en als er statistisch significante afwijkingen van de normaliteit worden gevonden, zal een logaritmische (of andere) transformatie worden toegepast. Correlaties zullen worden gezocht door de rangcorrelatiecoëfficiënt van de Spearman. Statistische significantie wordt verklaard bij p<0,05. Statistische analyses worden uitgevoerd met SPSS 12.0 (of hoger) voor MacOS X.

Het bereiken van de doelstellingen van het huidige onderzoeksproject zal:

1. vergroten van de kennis over de relatie tussen obesitas bij kinderen, ontsteking, insulineresistentie en vasculaire disfunctie;
2. ophelderen of postprandiale hyperlipemie, postprandiale inflammatie en/of postprandiale oxidant stress geassocieerd zijn met intermediaire fenotypes van atherosclerose bij obese kinderen/adolescenten;
3. potentiële nieuwe doelen vaststellen voor de preventie van obesitascomplicaties bij het kind / de adolescent en mogelijk nieuwe hulpmiddelen aangeven voor de behandeling van obesitasgerelateerde stoornissen.