소아 비만에서 식후 시간 동안 죽종형성의 기전

체지방 증가와 인슐린 저항성 사이의 관계에 대한 초기 개요 중 일부는 사람에게서 실험적으로 입증되지 않았습니다. 예를 들어, 사이토카인과 인슐린 감수성 사이의 인간에서 나타나는 대부분의 관계는 상관 관찰입니다.

비만 소아에서 지방간은 ​​매우 흔하며 다른 지방 저장소보다 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 고혈압 및 높은 수준의 염증 지표와 더 밀접하게 관련되어 있습니다. 따라서 전체 그림은 비만 아동/청소년의 죽상동맥경화증으로의 가속화된 추진력과 일치합니다. 사실, 죽상동맥경화증의 중간 표현형이 비만 아동에게서 검출될 수 있다는 몇몇 보고서가 입증되었습니다. 또한, 식후 단계는 죽종형성에서 그 자체의 역할을 하는 것으로 생각됩니다.

연구자들은 비만인 인슐린 저항성 아동에서 고지혈증, 산화제 스트레스 및 하위 염증과 같은 죽종형성의 메커니즘이 식후 단계에서 활성화되어 혈관 기능의 손상을 초래한다고 가정합니다.

연구 중인 매개변수:

1. 후보 트리거 에이전트

   • 식후 포도당
   • 식후 고지혈증
   • 식후 작고 조밀한 LDL
   • 식후 인슐린
   • 후보 메커니즘
   • 보완 활성화
   • C3

2. 염증

   • TNF-알파
   • 인터루킨-6(IL-6)
   • 인터루킨-10(IL-10)
   • C 반응성 단백질(CRP)
   • 산화제 스트레스
   • 소변 iso-PGF2-알파

3. 중간 표현형

   • 경동맥 내중막 두께(IMT)(기준선에서만)
   • 내피 기능(흐름 매개 혈관 확장)(FMD)
   • 동맥 경화(맥파 속도)(PWV)

실험 프로토콜 피험자는 하룻밤 금식 후 0800시에 베로나 시립 병원의 내분비 및 대사 질환과에 도착합니다. 체중, 키, 허리둘레, 혈압을 측정합니다. 전체 연구 동안 피험자는 조용하고 온도가 조절되는(22 °C) 방에서 침대에 누워 있을 것입니다. Teflon 정맥 카테터는 혈액 샘플링을 위해 전주정맥에 삽입되고 정상 식염수 천천히 점적 주입으로 특허를 유지합니다. 기준선 상태는 정맥 천자 후 침대에서 최소 20분간 휴식을 취한 후에 달성된 것으로 간주됩니다.

피험자는 적어도 2주 동안 혈관 기능을 방해하는 것으로 알려진 약물을 복용하지 않았어야 하며 연구 전 적어도 24시간 동안 카페인 함유 음료를 삼가도록 요청받을 것입니다. 수축기 혈압, 이완기 혈압, 평균 동맥압 및 심박수는 연구 기간 내내 Cardiocap II(Datex, 핀란드)를 사용하여 시간 간격으로 모니터링됩니다.

경동맥-대퇴 PWV는 Complior(Colson, Garges les Genosse, France)를 사용하여 평가될 것이다. 경동맥 IMT는 고해상도 US 컬러 도플러 스캔으로 평가됩니다. 그런 다음 비우세 총대퇴 동맥의 흐름 매개 내피 의존성 혈관 확장은 0.01mm의 축 해상도를 갖는 10MHz 선형 혈관 탐침을 사용하여 고해상도 에코 도플러(Esaote Biomedica AU6, Genova, Italy)로 평가합니다. 전단 응력의 프록시인 기준선 직경 및 혈류 속도는 적어도 3중으로 평가됩니다. 그 후, 혈압계 커프를 무릎 아래에 놓고 수축기 혈압보다 50mmHg 높게 부풀려 5분 동안 유지합니다. 혈관 직경과 유속은 조사관의 잘 확립된 프로토콜에 따라 커프를 수축한 후 시간 0.5', 2', 4', 6' 및 8'에서 측정됩니다. 이러한 조건에서 커프가 수축되면 허혈 후 충혈이 혈압 측정 커프의 원위 조직에서 발생합니다. 이 충혈은 커프에 근접하게 위치한 온대퇴동맥의 혈류 속도 증가를 유도할 것입니다. 유속의 증가와 그에 따른 전단 응력의 증가는 내피 의존성 혈관 확장을 유발합니다. 이 확장은 NO에 의존하는 것으로 나타났습니다. 흐름 의존성 혈관 확장의 글로벌 정량 지수는 절대 값 및 기준선 혈관 직경에 대한 백분율 변화로 표현되는 시간(관찰 8분)의 함수로 혈관 직경의 변화 곡선 아래 면적을 계산하여 얻을 수 있습니다. . 연구자의 손에서, 이 기법의 일일 변동 계수(n=15, 광범위한 혈관 반응 포함)는 23.0±3.8%입니다. 연구 목적을 위한 글리세릴-트리니트레이트 투여가 지역 기관 윤리 위원회에 의해 아동에게 윤리적으로 정당화될 수 없는 것으로 간주되기 때문에 내피 독립적 혈관 확장은 평가되지 않습니다.

연구자의 현재 경험(n=42 중증 비만 아동)에서 하룻밤 금식 후 평균 FMD는 1.40±0.91%입니다. 8분당(평균±표준편차) 동적 변화를 보여줄 수 있는 상당한 여지를 남깁니다. 이 중증 비만 어린이들에게서 이 연구자들은 FMD와 BMI 사이에 상관관계가 없음을 발견했습니다. 기술의 재현성을 높이는 데 도움이 되도록 현재 쌍으로 된 연구에 임시 기계식 미국 프로브 홀더가 사용됩니다. 또한 동맥 직경의 변화를 자동으로 계산하기 위한 특정 자동 윤곽선 추적 기술을 사용하여 이 방법의 작업자 의존성을 최소화합니다.

기준선(~10분 및 0') 혈액 샘플을 수집하여 포도당, 인슐린, C-펩티드, 표준 지질 프로필(총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 트리글리세리드), 산화-LDL, 아디포넥틴, 렙틴, C3, TNF를 측정합니다. -알파, IL-6, IL-10 및 CRP를 미세한 방법으로 사용하여 혈액 손실을 제한합니다. LDL 및 HDL 하위 분율을 측정하기 위해 별도의 샘플을 수집합니다. 세포막과 LDL 입자의 산소 자유 라디칼에 의해 촉매되는 비효소 지질 과산화에서 파생된 제품인 iso-PGF2-alpha를 측정하기 위해 기준선 소변을 수집합니다(43).

시간 0'에서 피험자는 알려진 칼로리 함량(체표면적 m2당 300kcal) 및 구성(탄수화물 53.8%, 지질 29.5%, 단백질 16.7%)의 혼합 액체 식사(Ensure Plus, 1.5kcal/cc)를 섭취합니다. 10분 이상. 포도당, 인슐린 및 C-펩티드는 +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240'에서 측정됩니다. 및 +300'. 표준 지질과 PWV는 +60', +120', +180', +240' 및 +300'에서 측정됩니다. 아디포넥틴, 렙틴, C3, TNF-알파, IL-6, IL-10, CRP, LDL 및 HDL 하위분획은 +180' 및 +300'에서 측정됩니다. FMD에 대한 +180' 평가가 반복됩니다. 식사 테스트가 끝날 때 소변을 수집하여 8-iso-PGF2-alpha를 평가합니다.

혈액 샘플은 +4 °C에서 1500g으로 빠르게 회전하고 혈장/혈청은 수집하여 -80° C에서 보관합니다. 소변 샘플은 -80° C에서 보관합니다. 총 혈액 손실은 100cc 미만으로 유지됩니다.

분석 방법 LDL/HDL 하위 분획 평가 및 소변 PGF2alpha를 제외하고, 소량의 혈장/혈청을 사용하도록 특별히 최적화된 방법을 사용하여 실혈을 최소화합니다. 포도당은 포도당 산화 효소 방법으로 Yellow Spring 포도당 분석기로 침대 옆에서 측정됩니다. C-펩티드 및 인슐린은 사내 ELISA 마이크로 방법으로 측정됩니다. 총 및 HDL 콜레스테롤과 총 트리글리세리드는 표준 사내 효소 미세 방법으로 평가됩니다. 아디포넥틴, 렙틴, C3, TNF-알파, IL-6, IL-10, CRP는 내부 면역 측정 마이크로 방법으로 평가됩니다. 8-Iso-PGF2alpha는 소변에서 추출한 후 면역 측정 분석으로 평가됩니다.

LDL/HDL 하위 분율은 교수의 실험실에서 측정됩니다. 파도바 대학교 의과대학의 Alberto Zambon 박사. 요약하면, 초원심분리기 튜브에서 불연속 염 밀도 구배를 생성한 후 샘플을 Sorvall TV-865B 수직 로터에서 10°C, 90분 동안 65,000rpm으로 원심분리합니다. 그런 다음 38개의 0.45ml 분획을 원심분리기 튜브 바닥에서 수집합니다. 콜레스테롤은 각 부분에서 측정됩니다. LDL 피크 부력을 특징짓고 LDL 크기/밀도의 척도인 상대 부양률(Rf)은 LDL 콜레스테롤 피크를 포함하는 분수 번호를 수집된 총 분수 수로 나누어 얻습니다.

베타 세포 기능 평가

베타 세포 기능은 약간의 수정을 가한 여러 실험실에서 제안한 일반 전략에 따라 혼합 식사 테스트 동안 포도당 및 C-펩티드 곡선을 분석하여 평가됩니다. 간단히 말해서, 인슐린 분비는 세 가지 구성 요소의 합입니다.

1. 기초(흡수후) 인슐린 분비율;
2. 혈장 글루코스 증가율에 대한 인슐린 분비("동적" 또는 "유도" 분비 성분);
3. 흡수 후 글루코스 농도 이상의 실제 글루코스 수준에 반응하는 인슐린 분비("정적" 또는 "비례" 분비 성분).

모델링 전략에 대한 완전한 설명은 연구자의 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다. 매개변수는 SAAM 1.1.2에서 이 최소 C-펩티드 분비 모델을 구현하여 추정됩니다. 소프트웨어 (SAAM Institute, 시애틀, WA). 알려지지 않은 매개변수의 수치 값은 비선형 최소 제곱법을 사용하여 추정됩니다.

가중치는 최적으로 선택됩니다. 즉, 평균이 0이고 변동 계수(CV)가 8%인 가산적이고 상관관계가 없는 것으로 가정되는 측정 오류 분산의 역수와 같습니다.

이 분석은 식후 동맥경화 과정이 일어나는 호르몬 시나리오를 제공할 것입니다.

통계 분석 데이터는 평균±SEM으로 요약됩니다. 샘플의 크기(각 그룹에서 n=20)는 20-40%의 차이에 대해 통계적 유의성을 달성할 확률이 80%가 되도록 선택되었습니다(검출 가능한 최소 차이는 연구 중인 변수마다 다름). 일반 추정 방정식 절차(GEE)는 반복 측정에 대해 양방향 ANOVA를 실행하고 필요한 경우 공변량을 조정하는 데 사용됩니다. 가우시안 분포는 모든 변수에서 테스트되며 정규성에서 통계적으로 유의미한 편차가 발견되면 로그(또는 기타) 변환이 적용됩니다. Spearman의 순위 상관 계수에 의해 상관 관계를 찾습니다. 통계적 유의성은 p<0.05에서 선언될 것이다. 통계 분석은 MacOS X용 SPSS 12.0(또는 그 이상)을 사용하여 수행됩니다.

현재 연구 프로젝트의 목표에 도달하는 것은 다음과 같습니다.

1. 아동 비만, 염증, 인슐린 저항성 및 혈관 기능 장애 사이의 관계에 대한 지식 확대;
2. 식후 고지혈증, 식후 염증 및/또는 식후 산화제 스트레스가 비만 아동/청소년의 죽상동맥경화증의 중간 표현형과 관련이 있는지 여부를 밝히고;
3. 아동/청소년의 비만 합병증 예방에 대한 잠재적인 새로운 목표를 설정하고 잠재적으로 비만 관련 장애의 치료를 위한 새로운 도구를 나타냅니다.