Mekanismer för aterogenes under postprandial tid i barndomsfetma

Några av tidigare konturer av sambanden mellan förstorad fettmassa och insulinresistens har inte bevisats experimentellt hos människa. Till exempel är de flesta av de samband som visas hos människor mellan cytokiner och insulinkänslighet korrelationsobservationer.

Hos det feta barnet är fettlever ganska utbredd och är närmare associerad än andra fettdepåer till insulinresistens, dyslipidemi, högt blodtryck och till höga nivåer av inflammationsmarkörer. Hela bilden överensstämmer därför med en accelererad drift till ateroskleros hos det feta barnet/ungdomen. Faktum är att flera rapporter har visat att mellanliggande fenotyper av åderförkalkning kan upptäckas hos det feta barnet. Dessutom tros den postprandiala fasen spela en egen roll vid aterogenes.

Forskarna antar att hos överviktiga insulinresistenta barn aktiveras aterogenesmekanismer, såsom hyperlipemi, oxidant stress och subinflammation, i den postprandiala fasen, vilket resulterar i försämringar av kärlfunktionen.

Parametrar som studeras:

1. Kandidatutlösande agenter

   • Postprandial glukos
   • Postprandial hyperlipemi
   • Postprandial liten tät LDL
   • Postprandialt insulin
   • Kandidatmekanismer
   • Komplementaktivering
   • C3

2. Inflammation

   • TNF-alfa
   • Interleukin-6 (IL-6)
   • Interleukin-10 (IL-10)
   • C-reaktivt protein (CRP)
   • Oxidant stress
   • Urin iso-PGF2-alfa

3. Mellanliggande fenotyper

   • Carotid artery intima-media thickness (IMT) (endast vid baslinjen)
   • Endotelfunktion (flödesmedierad vasodilatation) (FMD)
   • Arteriell stelhet (pulsvågshastighet) (PWV)

Försöksprotokoll Försökspersoner kommer att anlända till avdelningen för endokrinologi och metabola sjukdomar på Verona City Hospital kl. 08.00 efter en fasta över natten. Vikt, längd, midjemått och blodtryck kommer att mätas. Under hela studien kommer försökspersonerna att ligga i sängen i ett tyst, temperaturkontrollerat (22 °C) rum. En venkateter av Teflon kommer att föras in i en antecubital ven för blodprovstagning och kommer att hållas patenterad med en normal infusion med långsamt droppande saltlösning. Baslinjetillståndet anses uppnått efter minst 20 minuters vila i sängen efter venpunktion.

Försökspersoner får inte ha tagit några läkemedel som är kända för att störa kärlfunktionen i minst 2 veckor och kommer att uppmanas att avstå från koffeinhaltiga drycker i minst 24 timmar före studien. Systoliskt blodtryck, diastoliskt blodtryck, medelartärtryck och hjärtfrekvens kommer att övervakas med tidsintervall med Cardiocap II (Datex, Finland) under hela studien.

Carotis-femoral PWV kommer att bedömas med Complior (Colson, Garges les Genosse, Frankrike). Halspulsåder IMT kommer att bedömas med högupplöst amerikansk färg-doppler-skanning. Därefter kommer flödesmedierad endotelberoende vasodilatation av den icke-dominanta gemensamma femorala artären att bedömas med högupplöst ekodoppler (Esaote Biomedica AU6, Genova, Italien), med en 10 MHz linjär vaskulär sond med axiell upplösning på 0,01 mm. Baslinjediameter och blodflödeshastighet, en proxy för skjuvspänning, kommer att bedömas åtminstone i tre exemplar. Efter detta kommer en sfygmomanometrisk manschett att läggas under knät och blåses upp 50 mm Hg högre än systoliskt blodtryck och bibehålls i 5'. Kärldiameter och flödeshastighet kommer att mätas vid tidpunkten 0,5', 2', 4', 6' och 8' efter att manschetten tömts, enligt utredarnas väletablerade protokoll. Under dessa förhållanden, när manschetten är tömd, kommer postischemisk hyperemi att äga rum i vävnaderna som är distala om den sfygmomanometriska manschetten. Denna hyperemi kommer att inducera en ökning av blodflödeshastigheten i den gemensamma femorala artären, som är belägen proximalt till manschetten. Ökningen i flödeshastighet, och den efterföljande ökningen av skjuvspänning, framkallar en endotelberoende vasodilatation. Det har visat sig att denna utvidgning är NO-beroende. Ett globalt kvantitativt index för flödesberoende vasodilatation kommer att erhållas genom att beräkna arean under kurvan för förändring i kärldiameter som funktion av tiden (8 min observation), uttryckt både som absoluta värden och som procentuella förändringar över baslinjens kärldiameter . I utredarnas händer är variationskoefficienten mellan dagar för denna teknik (n=15, som täcker ett brett spektrum av vaskulär respons) 23,0±3,8%. Endoteloberoende vasodilatation kommer inte att utvärderas eftersom administrering av glyceryltrinitrat för forskningsändamål anses etiskt oförsvarligt hos barn av den lokala institutionella etiska kommittén.

Enligt utredarnas nuvarande erfarenhet (n=42 svårt överviktiga barn) är den genomsnittliga mul- och klövsjuka efter en fasta över natten 1,40±0,91 % per 8 minuter (medelvärde±SD), vilket lämnar stort utrymme för att visa dynamiska förändringar. Hos dessa svårt överviktiga barn fann dessa utredare ingen korrelation mellan MKS och BMI. En ad hoc mekanisk amerikansk sondhållare kommer att användas i de aktuella parade studierna, med målet att hjälpa till att öka reproducerbarheten av tekniken. Dessutom kommer en specifik automatisk konturspårningsteknik för automatisk beräkning av förändringarna i artärdiametern att användas för att minimera operatörens beroende av denna metod.

Baslinje (-10 min och 0') blodprover kommer att samlas in för att mäta glukos, insulin, C-peptid, standard lipidprofil (totalkolesterol, HDL-kolesterol och triglycerider), oxiderad-LDL, adiponektin, leptin, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 och CRP genom mikrometoder för att begränsa blodförlust. Ett separat prov kommer att samlas in för att mäta LDL- och HDL-subfraktioner. Baslinjeurin kommer att samlas in för att mäta iso-PGF2-alfa, en produkt som härrör från icke-enzymatisk lipidperoxidation, katalyserad av fria syreradikaler på cellmembran och LDL-partiklar (43).

Vid tidpunkten 0' får försökspersonerna en blandad flytande måltid (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) med känt kaloriinnehåll (300 kcal per m2 kroppsyta) och sammansättning (53,8 % kolhydrater, 29,5 % lipider, 16,7 % proteiner) över 10 minuter. Glukos, insulin och C-peptid kommer att mätas vid +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' och +300'. Standardlipider och PWV kommer att mätas vid +60', +120', +180', +240' och +300'. Adiponektin, leptin, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP och LDL och HDL-subfraktioner kommer att mätas vid +180' och +300'. Vid tidpunkten kommer +180' bedömning av mul- och klövsjuka att upprepas. Vid slutet av måltiden kommer urin att samlas in för att bedöma 8-iso-PGF2-alfa.

Blodprover kommer snabbt att centrifugeras vid 1500 g vid +4 °C, plasma/serum kommer att samlas upp och förvaras vid -80 °C. Urinprov kommer att förvaras vid -80 °C. Total blodförlust kommer att hållas under 100 cc.

Analytiska metoder Förutom LDL/HDL-subfraktionsbedömning och urin PGF2alpha kommer metoder som är specifikt optimerade för att använda små mängder plasma/serum att användas för att minimera blodförlusten. Glukos kommer att mätas vid sängkanten med en Yellow Spring Glucose Analyzer med glukosoxidasmetoden. C-peptid och insulin kommer att mätas med interna ELISA-mikrometoder. Totalt och HDL-kolesterol och totala triglycerider kommer att bedömas med standardinterna enzymatiska mikrometoder. Adiponectin, leptin, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP kommer att bedömas med interna immunometriska mikrometoder. 8-Iso-PGF2alpha kommer att bedömas med en immunometrisk analys efter extraktion från urin.

LDL/HDL-subfraktioner kommer att mätas i laboratoriet hos prof. Alberto Zambon, vid University of Padua School of Medicine. Kortfattat, efter att ha skapat en diskontinuerlig saltdensitetsgradient i ett ultracentrifugrör, kommer proverna att centrifugeras vid 65 000 rpm i 90 minuter vid 10°C i en Sorvall TV-865B vertikal rötor. Trettioåtta fraktioner om 0,45 ml samlas sedan upp från botten av centrifugröret. Kolesterol mäts i varje fraktion. Den relativa flotationshastigheten (Rf), som kännetecknar LDL-toppflytkraft och är ett mått på LDL-storlek/densitet, erhålls genom att dividera fraktionstalet som innehåller LDL-kolesteroltoppen med det totala antalet uppsamlade fraktioner.

Bedömning av beta-cellsfunktion

Beta-cellsfunktion kommer att utvärderas genom att analysera glukos- och C-peptidkurvorna under testet med blandade måltider, enligt den allmänna strategi som föreslås av flera laboratorier med några små modifieringar. Kortfattat är insulinsekretionen summan av tre komponenter:

1. basala (postabsorptiva) insulinutsöndringshastigheter;
2. insulinutsöndring som svar på ökningshastigheten i plasmaglukos ("dynamisk" eller "derivat" sekretionskomponent);
3. insulinutsöndring som svar på de faktiska glukosnivåerna över den postabsorptiva glukoskoncentrationen ("statisk" eller "proportionell" sekretionskomponent).

En fullständig beskrivning av modelleringsstrategin finns i utredarnas tidigare publikationer. Parametrar kommer att uppskattas genom att implementera denna minimala modell av C-peptidutsöndring i SAAM 1.1.2 programvara (SAAM Institute, Seattle, WA). Numeriska värden för de okända parametrarna kommer att uppskattas genom att använda ickelinjära minsta kvadrater.

Vikter väljs optimalt, dvs. lika med inversen av variansen av mätfelen, som antas vara additiv, okorrelerade, med noll medelvärde och en konstant variationskoefficient (CV) på 8 %.

Denna analys kommer att ge det hormonella scenariot där de postprandiala aterogenetiska processerna äger rum.

Statistisk analys Data kommer att sammanfattas som medel±SEM. Storleken på urvalet (n=20 i varje grupp) har valts ut med målet att ha 80 % chans att uppnå statistisk signifikans för skillnader på 20-40 % (den minsta påvisbara skillnaden varierar från variabel till variabel som studeras). Den allmänna skattningsekvationsproceduren (GEE) kommer att användas för att köra 2-vägs ANOVA för upprepade mätningar och för att justera för kovariater, om det behövs. Gaussfördelning kommer att testas i alla variabler, och om statistiskt signifikanta avvikelser från normalitet hittas kommer logaritmisk (eller annan) transformation att tillämpas. Korrelationer kommer att sökas av Spearmans rangkorrelationskoefficient. Statistisk signifikans kommer att deklareras till p<0,05. Statistiska analyser kommer att utföras med SPSS 12.0 (eller högre) för MacOS X.

Att nå målen för detta forskningsprojekt kommer att:

1. utöka kunskapen om sambandet mellan barndomsfetma, inflammation, insulinresistens och vaskulär dysfunktion;
2. klargöra om postprandial hyperlipemi, postprandial inflammation och/eller postprandial oxidant stress är associerade med intermediära fenotyper av ateroskleros hos det feta barnet/ungdomen;
3. fastställa potentiella nya mål för förebyggande av fetmakomplikationer hos barnet/ungdomen och potentiellt indikera nya verktyg för behandling av fetmarelaterade störningar.