Mechanismy aterogeneze během postprandiálního období u dětské obezity

Některé z dřívějších náčrtů vztahů mezi zvětšenou tukovou hmotou a inzulinovou rezistencí nebyly u člověka experimentálně prokázány. Například většina vztahů ukázaných u lidí mezi cytokiny a citlivostí na inzulín jsou korelační pozorování.

U obézních dětí je ztučnění jater poměrně převládající a je těsněji spojeno než jiné zásoby tuku s inzulínovou rezistencí, dyslipidémií, vysokým krevním tlakem a vysokými hladinami zánětlivých markerů. Celkový obraz je tedy v souladu se zrychleným náporem na aterosklerózu u obézních dětí/dospívajících. Několik zpráv skutečně prokázalo, že u obézního dítěte lze detekovat intermediární fenotypy aterosklerózy. Dále se předpokládá, že postprandiální fáze hraje svou vlastní roli v aterogenezi.

Výzkumníci předpokládají, že u obézních dětí s inzulínovou rezistencí jsou mechanismy aterogeneze, jako je hyperlipémie, oxidační stres a sub-zánět, aktivovány v postprandiální fázi, což vede k poškození vaskulární funkce.

Zkoumané parametry:

1. Kandidátní spouštěcí agenti

   • Postprandiální glukóza
   • Postprandiální hyperlipémie
   • Postprandiální malé husté LDL
   • Postprandiální inzulín
   • Kandidátské mechanismy
   • Aktivace doplňku
   • C3

2. Zánět

   • TNF-alfa
   • Interleukin-6 (IL-6)
   • Interleukin-10 (IL-10)
   • C-reaktivní protein (CRP)
   • Oxidační stres
   • Iso-PGF2-alfa v moči

3. Střední fenotypy

   • Tloušťka intima-media karotické tepny (IMT) (pouze na začátku)
   • Endoteliální funkce (průtokem zprostředkovaná vazodilatace) (FMD)
   • Arteriální tuhost (rychlost pulsní vlny) (PWV)

Experimentální protokol Subjekty dorazí na oddělení endokrinologie a metabolických chorob ve Verona City Hospital v 08:00 po celonočním hladovění. Měří se váha, výška, obvod pasu a krevní tlak. Během celé studie budou subjekty ležet na lůžku v tiché místnosti s řízenou teplotou (22 °C). Teflonový žilní katétr se zavede do antekubitální žíly za účelem odběru krve a bude udržován v průchodnosti normální infuzí s pomalým odkapáváním fyziologického roztoku. Výchozí stav bude považován za dosažený po nejméně 20 minutách odpočinku na lůžku po punkci žíly.

Subjekty nesměly užívat žádné léky, o nichž je známo, že interferují s vaskulární funkcí, alespoň 2 týdny a budou požádáni, aby se zdrželi nápojů obsahujících kofein po dobu alespoň 24 hodin před studií. Systolický krevní tlak, diastolický krevní tlak, střední arteriální tlak a srdeční frekvence budou monitorovány v časových intervalech pomocí Cardiocap II (Datex, Finsko) v průběhu studie.

Karotid-femorální PWV bude hodnocena pomocí Complior (Colson, Garges les Genosse, Francie). Karotická tepna IMT bude hodnocena barevným dopplerovským skenem s vysokým rozlišením. Poté bude hodnocena průtokově zprostředkovaná endotelově závislá vazodilatace nedominantní arteria femoralis communis pomocí echo-dopplera s vysokým rozlišením (Esaote Biomedica AU6, Genova, Itálie), s 10 MHz lineární vaskulární sondou s axiálním rozlišením 0,01 mm. Základní průměr a rychlost krevního toku, jako zástupce smykového napětí, budou hodnoceny alespoň třikrát. Poté se pod koleno nasadí sfygmomanometrická manžeta a nafoukne se o 50 mm Hg výše, než je systolický krevní tlak a udržuje se po dobu 5 minut. Průměr cévy a rychlost proudění budou měřeny v čase 0,5', 2', 4', 6' a 8' po vyfouknutí manžety, podle dobře zavedeného protokolu vyšetřovatelů. Za těchto podmínek, když je manžeta vypuštěna, dojde k postischemické hyperémii v tkáních, které jsou distálně od sfygmomanometrické manžety. Tato hyperémie vyvolá zvýšení rychlosti průtoku krve společnou stehenní tepnou, která se nachází proximálně k manžetě. Zvýšení rychlosti proudění a následné zvýšení smykového napětí vyvolávají vazodilataci závislou na endotelu. Ukázalo se, že tato dilatace je závislá na NO. Globální kvantitativní index vazodilatace závislé na průtoku se získá výpočtem plochy pod křivkou změny průměru cévy jako funkce času (8 minut pozorování), vyjádřené jak jako absolutní hodnoty, tak jako procentuální změny oproti základnímu průměru cévy. . V rukou vyšetřovatelů je variační koeficient mezi dny této techniky (n=15, pokrývající široký rozsah vaskulární odpovědi) 23,0±3,8 %. Vasodilatace nezávislá na endotelu nebude hodnocena, protože podávání glyceryl-trinitrátu pro výzkumné účely je místní institucionální etickou komisí u dětí považováno za eticky neospravedlnitelné.

Podle současných zkušeností výzkumníků (n=42 těžce obézních dětí) je průměrná slintavka a kulhavka po nočním hladovění 1,40±0,91 % za 8 minut (průměr ± SD), čímž je ponechán značný prostor pro zobrazení dynamických změn. U těchto těžce obézních dětí tito výzkumníci nenašli žádnou korelaci mezi FMD a BMI. V těchto párových studiích bude použit ad hoc mechanický držák US sondy s cílem pomoci zvýšit reprodukovatelnost techniky. Dále bude použita specifická technika automatického sledování obrysu pro automatický výpočet změn průměru tepny, aby se minimalizovala závislost operátora na této metodě.

Odeberou se základní (-10 min a 0') krevní vzorky pro měření glukózy, inzulínu, C-peptidu, standardního lipidového profilu (celkový cholesterol, HDL-cholesterol a triglyceridy), oxidovaného LDL, adiponektinu, leptinu, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 a CRP mikrometodami k omezení krevních ztrát. Pro měření LDL a HDL subfrakcí bude odebrán samostatný vzorek. Základní moč bude odebírána za účelem měření iso-PGF2-alfa, produktu odvozeného z neenzymatické peroxidace lipidů, katalyzované volnými kyslíkovými radikály na buněčných membránách a LDL částicích (43).

V čase 0' subjekty přijmou smíšené tekuté jídlo (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) o známém kalorickém obsahu (300 kcal na m2 tělesného povrchu) a složení (53,8 % sacharidů, 29,5 % lipidů, 16,7 % bílkovin) přes 10 minut. Glukóza, inzulín a C-peptid budou měřeny při +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' a +300'. Standardní lipidy a PWV budou měřeny při +60', +120', +180', +240' a +300'. Adiponektin, leptin, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP a LDL a HDL subfrakce budou měřeny při +180' a +300'. V čase +180' se bude hodnocení FMD opakovat. Na konci testu s jídlem se odebere moč pro stanovení 8-iso-PGF2-alfa.

Vzorky krve budou rychle odstředěny při 1500 g při +4 °C, plazma/sérum budou odebrány a uloženy při -80 °C. Vzorky moči budou uchovávány při -80 °C. Celková ztráta krve bude udržována pod 100 ml.

Analytické metody Kromě stanovení LDL/HDL subfrakcí a moči PGF2alfa budou použity metody specificky optimalizované pro použití malých množství plazmy/séra k minimalizaci krevních ztrát. Glukóza bude měřena u lůžka pomocí Yellow Spring Glucose Analyzer metodou glukózooxidázy. C-peptid a inzulín budou měřeny vlastními mikrometodami ELISA. Celkový a HDL cholesterol a celkové triglyceridy budou hodnoceny standardními interními enzymatickými mikrometodami. Adiponektin, leptin, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP budou hodnoceny vlastními imunometrickými mikrometodami. 8-Iso-PGF2alfa bude hodnocen imunometrickým testem po extrakci z moči.

LDL/HDL subfrakce budou měřeny v laboratoři prof. Alberto Zambon z lékařské fakulty univerzity v Padově. Stručně řečeno, po vytvoření nespojitého gradientu hustoty soli v ultracentrifugační zkumavce budou vzorky centrifugovány při 65 000 otáčkách za minutu po dobu 90 minut při 10 °C ve vertikálním rotoru Sorvall TV-865B. Ze dna centrifugační zkumavky se pak shromáždí 38 0,45ml frakcí. Cholesterol se měří v každé frakci. Relativní rychlost flotace (Rf), která charakterizuje maximální vztlak LDL a je měřítkem velikosti/hustoty LDL, se získá vydělením čísla frakce obsahující pík LDL cholesterolu celkovým počtem odebraných frakcí.

Hodnocení funkce beta-buněk

Funkce beta-buněk bude vyhodnocena analýzou křivek glukózy a C-peptidu během testu se smíšeným jídlem, podle obecné strategie navržené několika laboratořemi s určitými drobnými úpravami. Stručně řečeno, sekrece inzulínu je součtem tří složek:

1. bazální (postabsorpční) rychlosti sekrece inzulínu;
2. sekrece inzulínu v reakci na rychlost zvýšení plazmatické glukózy ("dynamická" nebo "derivátová" sekreční složka);
3. sekrece inzulínu v reakci na aktuální hladiny glukózy nad postabsorpční koncentrací glukózy ("statická" nebo "proporcionální" sekreční složka).

Úplný popis strategie modelování lze nalézt v dřívějších publikacích vyšetřovatelů. Parametry budou odhadnuty implementací tohoto minimálního modelu sekrece C-peptidu v SAAM 1.1.2 software (SAAM Institute, Seattle, WA). Numerické hodnoty neznámých parametrů budou odhadnuty pomocí nelineárních nejmenších čtverců.

Váhy se volí optimálně, tj. rovny převrácené hodnotě rozptylu chyb měření, o kterých se předpokládá, že jsou aditivní, nekorelované, s nulovým průměrem a konstantním variačním koeficientem (CV) 8 %.

Tato analýza poskytne hormonální scénář, ve kterém probíhají postprandiální aterogenetické procesy.

Statistická analýza Data budou shrnuta jako průměr ± SEM. Velikost vzorku (n=20 v každé skupině) byla vybrána s cílem mít 80% šanci na dosažení statistické významnosti pro rozdíly 20-40% (minimální detekovatelný rozdíl se mění proměnná od studované proměnné). Postup obecné odhadovací rovnice (GEE) bude použit ke spuštění 2-cestné ANOVA pro opakovaná měření a v případě potřeby k úpravě pro kovariáty. Gaussovo rozdělení bude testováno ve všech proměnných, a pokud budou nalezeny statisticky významné odchylky od normality, bude aplikována logaritmická (nebo jiná) transformace. Korelace budou hledány Spearmanovým koeficientem hodnostní korelace. Statistická významnost bude deklarována při p<0,05. Statistické analýzy budou prováděny pomocí SPSS 12.0 (nebo vyšší) pro MacOS X.

Dosažení cílů tohoto výzkumného projektu bude:

1. rozšířit znalosti o vztahu mezi dětskou obezitou, zánětem, inzulinovou rezistencí a vaskulární dysfunkcí;
2. objasnit, zda postprandiální hyperlipémie, postprandiální zánět a/nebo postprandiální oxidační stres jsou spojeny se středními fenotypy aterosklerózy u obézního dítěte/dospívajícího;
3. stanovit potenciální nové cíle prevence komplikací obezity u dětí/dospívajících a potenciálně ukázat nové nástroje pro léčbu poruch spojených s obezitou.