Механизмы атерогенеза в постпрандиальное время при детском ожирении

Некоторые из более ранних набросков связи между увеличенной жировой массой и резистентностью к инсулину не были подтверждены экспериментально у человека. Например, большинство взаимосвязей, показанных у людей между цитокинами и чувствительностью к инсулину, являются корреляционными наблюдениями.

У детей с ожирением жировая дистрофия печени довольно распространена и более тесно связана, чем другие жировые депо, с резистентностью к инсулину, дислипидемией, высоким кровяным давлением и высокими уровнями маркеров воспаления. Таким образом, вся картина согласуется с ускоренным стремлением к атеросклерозу у детей/подростков с ожирением. Действительно, несколько сообщений показали, что промежуточные фенотипы атеросклероза могут быть обнаружены у детей с ожирением. Более того, считается, что постпрандиальная фаза играет свою роль в атерогенезе.

Исследователи предполагают, что у детей с ожирением и резистентностью к инсулину механизмы атерогенеза, такие как гиперлипемия, оксидантный стресс и субвоспаление, активируются в постпрандиальную фазу, что приводит к нарушению сосудистой функции.

Исследуемые параметры:

1. Кандидаты в триггерные агенты

   • Постпрандиальная глюкоза
   • Постпрандиальная гиперлипемия
   • Постпрандиальные малые плотные ЛПНП
   • Постпрандиальный инсулин
   • Механизмы-кандидаты
   • Активация комплемента
   • С3

2. Воспаление

   • ФНО-альфа
   • Интерлейкин-6 (ИЛ-6)
   • Интерлейкин-10 (ИЛ-10)
   • С-реактивный белок (СРБ)
   • Оксидантный стресс
   • Мочевой изо-PGF2-альфа

3. Промежуточные фенотипы

   • Толщина комплекса интима-медиа сонных артерий (ТИМ) (только на исходном уровне)
   • Эндотелиальная функция (расширение сосудов, опосредованное потоком) (FMD)
   • Артериальная жесткость (скорость пульсовой волны) (PWV)

Экспериментальный протокол Субъекты прибывают в отделение эндокринологии и метаболических заболеваний городской больницы Вероны в 08:00 после ночного голодания. Будут измеряться вес, рост, окружность талии и артериальное давление. В течение всего исследования испытуемые будут лежать в постели в тихой комнате с регулируемой температурой (22 °C). Тефлоновый венозный катетер будет вставлен в локтевую вену для забора крови и будет оставаться открытым с помощью медленного вливания физиологического раствора. Исходное состояние считается достигнутым после как минимум 20-минутного отдыха в постели после пункции вены.

Субъекты не должны были принимать препараты, которые, как известно, влияют на функцию сосудов, в течение как минимум 2 недель, и им будет предложено воздержаться от напитков, содержащих кофеин, по крайней мере за 24 часа до исследования. Систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, среднее артериальное давление и частота сердечных сокращений будут контролироваться с временными интервалами с помощью Cardiocap II (Datex, Финляндия) на протяжении всего исследования.

Каротидно-бедренная PWV будет оцениваться с помощью Complior (Colson, Garges les Genosse, Франция). IMT сонных артерий будет оцениваться с помощью цветного допплеровского сканирования высокого разрешения. Затем с помощью эхо-доплера высокого разрешения (Esaote Biomedica AU6, Генуя, Италия) с линейным сосудистым датчиком 10 МГц с аксиальным разрешением 0,01 мм оценивают эндотелийзависимую вазодилатацию недоминантной общей бедренной артерии, опосредованную потоком. Исходный диаметр и скорость кровотока, показатель напряжения сдвига, будут оцениваться, по крайней мере, в трех повторностях. После этого под колено помещается сфигмоманометрическая манжета, которая надувается на 50 мм рт. ст. выше систолического артериального давления и удерживается в течение 5 минут. Диаметр сосуда и скорость потока будут измеряться через 0,5 мин, 2 мин, 4 мин, 6 мин и 8 мин после спуска воздуха из манжеты в соответствии с общепринятым протоколом исследователей. В этих условиях при сдувании манжетки в тканях, расположенных дистальнее сфигмоманометрической манжеты, будет иметь место постишемическая гиперемия. Эта гиперемия будет вызывать увеличение скорости кровотока в общей бедренной артерии, расположенной проксимальнее манжеты. Увеличение скорости кровотока и последующее увеличение напряжения сдвига вызывают эндотелийзависимую вазодилатацию. Было показано, что это расширение является NO-зависимым. Глобальный количественный показатель вазодилатации, зависящей от потока, будет получен путем расчета площади под кривой изменения диаметра сосуда в зависимости от времени (8 мин наблюдения), выраженного как в абсолютных значениях, так и в процентах изменений относительно исходного диаметра сосуда. . В руках исследователей междневной коэффициент вариации этой методики (n=15, охватывающий широкий спектр сосудистой реакции) составляет 23,0±3,8%. Эндотелий-независимая вазодилатация не будет оцениваться, поскольку местный институциональный комитет по этике считает введение глицерилтринитрата в исследовательских целях этически неоправданным у детей.

Согласно текущему опыту исследователей (n = 42 ребенка с тяжелым ожирением), средний показатель ящура после ночного голодания составляет 1,40 ± 0,91%. за 8 минут (среднее значение ± стандартное отклонение), что оставляет достаточно места для демонстрации динамических изменений. У этих детей с тяжелым ожирением эти исследователи не обнаружили корреляции между ящуром и ИМТ. В настоящих парных исследованиях будет использоваться специальный механический держатель ультразвукового зонда с целью повышения воспроизводимости методики. Кроме того, будет использоваться специальный метод автоматического отслеживания контуров для автоматического расчета изменений диаметра артерии, чтобы свести к минимуму зависимость этого метода от оператора.

Исходные (-10 минут и 0') образцы крови будут собраны для измерения уровня глюкозы, инсулина, С-пептида, стандартного профиля липидов (общий холестерин, ЛПВП-холестерин и триглицериды), окисленных ЛПНП, адипонектина, лептина, С3, ФНО. -альфа, ИЛ-6, ИЛ-10 и СРБ микрометодами для ограничения кровопотери. Отдельный образец будет собран для измерения подфракций ЛПНП и ЛПВП. Исходный уровень мочи будет собираться для измерения изо-PGF2-альфа, продукта, полученного в результате неферментативного перекисного окисления липидов, катализируемого свободными радикалами кислорода на клеточных мембранах и частицами ЛПНП (43).

В момент времени 0' субъекты будут принимать смешанную жидкую пищу (Ensure Plus, 1,5 ккал/см3) с известной калорийностью (300 ккал на м2 площади поверхности тела) и составом (53,8% углеводов, 29,5% липидов, 16,7% белков). более 10 минут. Глюкоза, инсулин и С-пептид будут измеряться при +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240'. и +300'. Стандартные липиды и PWV будут измеряться при +60, +120, +180, +240 и +300. Адипонектин, лептин, C3, TNF-альфа, IL-6, IL-10, CRP и субфракции LDL и HDL будут измеряться при +180' и +300'. В момент времени +180 мин оценка ящура будет повторена. В конце теста с едой будет собрана моча для оценки 8-изо-PGF2-альфа.

Образцы крови будут быстро центрифугироваться при 1500 г при +4 °C, плазма/сыворотка будет собрана и храниться при -80 °C. Образцы мочи будут храниться при -80 °C. Общая потеря крови будет поддерживаться на уровне ниже 100 см3.

Аналитические методы За исключением оценки подфракций ЛПНП/ЛПВП и PGF2-альфа мочи, для минимизации кровопотери будут использоваться методы, специально оптимизированные для использования небольших количеств плазмы/сыворотки. Глюкоза будет измеряться у постели больного с помощью анализатора глюкозы Yellow Spring методом глюкозооксидазы. С-пептид и инсулин будут измеряться с помощью микрометодов ELISA. Общий холестерин, холестерин ЛПВП и общие триглицериды будут оцениваться стандартными внутренними ферментативными микрометодами. Адипонектин, лептин, С3, ФНО-альфа, ИЛ-6, ИЛ-10, СРБ будут оцениваться собственными иммунометрическими микрометодами. 8-Iso-PGF2alpha будет оцениваться иммунометрическим анализом после извлечения из мочи.

Подфракции ЛПНП/ЛПВП будут измеряться в лаборатории проф. Альберто Замбон, медицинский факультет Падуанского университета. Вкратце, после создания прерывистого градиента плотности соли в ультрацентрифужной пробирке образцы центрифугируют при 65 000 об/мин в течение 90 мин при 10°C в вертикальном роторе Sorvall TV-865B. Затем со дна центрифужной пробирки собирают 38 фракций по 0,45 мл. Холестерин измеряется в каждой фракции. Относительная скорость флотации (Rf), которая характеризует пиковую плавучесть ЛПНП и является мерой размера/плотности ЛПНП, получается путем деления номера фракции, содержащей пик холестерина ЛПНП, на общее количество собранных фракций.

Оценка функции бета-клеток

Функция бета-клеток будет оцениваться путем анализа кривых глюкозы и С-пептида во время теста смешанного питания в соответствии с общей стратегией, предложенной несколькими лабораториями, с некоторыми небольшими изменениями. Вкратце, секреция инсулина представляет собой сумму трех компонентов:

1. базальная (постабсорбционная) скорость секреции инсулина;
2. секреция инсулина в ответ на скорость увеличения уровня глюкозы в плазме («динамический» или «производный» компонент секреции);
3. секреция инсулина в ответ на фактические уровни глюкозы выше постабсорбционной концентрации глюкозы («статический» или «пропорциональный» компонент секреции).

Полное описание стратегии моделирования можно найти в более ранних публикациях исследователей. Параметры будут оцениваться путем реализации этой минимальной модели секреции С-пептида в SAAM 1.1.2. программное обеспечение (Институт SAAM, Сиэтл, Вашингтон). Численные значения неизвестных параметров будут оцениваться с использованием нелинейного метода наименьших квадратов.

Веса выбираются оптимально, т. е. равными обратной величине дисперсии ошибок измерения, которые предполагаются аддитивными, некоррелированными, с нулевым средним и постоянным коэффициентом вариации (CV) 8%.

Этот анализ даст гормональный сценарий, при котором происходят постпрандиальные атерогенетические процессы.

Статистический анализ. Данные будут суммированы как среднее ± стандартная ошибка среднего. Размер выборки (n=20 в каждой группе) был выбран с целью иметь 80%-ную вероятность достижения статистической значимости для различий в 20-40% (минимальное обнаруживаемое различие варьируется от исследуемой переменной к переменной). Процедура общего оценочного уравнения (GEE) будет использоваться для проведения двухфакторного дисперсионного анализа для повторных измерений и для корректировки ковариат, если это необходимо. Распределение Гаусса будет проверено во всех переменных, и, если будут обнаружены статистически значимые отклонения от нормальности, будет применено логарифмическое (или другое) преобразование. Корреляции будем искать по коэффициенту ранговой корреляции Спирмена. Статистическая значимость будет объявлена ​​при p<0,05. Статистический анализ будет выполняться с использованием SPSS 12.0 (или выше) для MacOS X.

Достижение целей настоящего исследовательского проекта позволит:

1. расширить знания о взаимосвязи между детским ожирением, воспалением, резистентностью к инсулину и сосудистой дисфункцией;
2. выяснить, связаны ли постпрандиальная гиперлипемия, постпрандиальное воспаление и/или постпрандиальный оксидантный стресс с промежуточными фенотипами атеросклероза у детей/подростков с ожирением;
3. установить потенциальные новые цели профилактики осложнений ожирения у детей/подростков и потенциально указать новые средства для лечения нарушений, связанных с ожирением.