Aterogeneesin mekanismit aterian jälkeisenä aikana lasten liikalihavuudessa

Joitakin aikaisempia pääpiirteitä suurentuneen rasvamassan ja insuliiniresistenssin välisistä suhteista ei ole todistettu kokeellisesti ihmisellä. Esimerkiksi suurin osa ihmisillä sytokiinien ja insuliiniherkkyyden välisistä suhteista on korrelaatiohavaintoja.

Lihavilla lapsilla rasvamaksa on melko yleistä, ja se liittyy muita rasvavarastoja läheisemmin insuliiniresistenssiin, dyslipidemiaan, korkeaan verenpaineeseen ja korkeaan tulehdusmerkkiainetasoon. Koko kuva on siis yhdenmukainen liikalihavien lasten/nuorten kiihtyneen ateroskleroosin kanssa. Itse asiassa useat raportit ovat osoittaneet, että lihavilla lapsilla voidaan havaita ateroskleroosin keskitason fenotyyppejä. Lisäksi aterian jälkeisellä vaiheella uskotaan olevan oma roolinsa aterogeneesissä.

Tutkijat olettavat, että lihavilla insuliiniresistenteillä lapsilla aterogeneesin mekanismit, kuten hyperlipemia, hapetusstressi ja osatulehdus, aktivoituvat aterian jälkeisessä vaiheessa, mikä johtaa verisuonten toiminnan heikkenemiseen.

Tutkittavat parametrit:

1. Ehdokkaat laukaisevat aineet

   • Aterian jälkeinen glukoosi
   • Aterian jälkeinen hyperlipemia
   • Aterian jälkeinen pieni tiheä LDL
   • Aterian jälkeinen insuliini
   • Ehdokasmekanismit
   • Täydennä aktivointia
   • C3

2. Tulehdus

   • TNF-alfa
   • Interleukiini-6 (IL-6)
   • Interleukiini-10 (IL-10)
   • C-reaktiivinen proteiini (CRP)
   • Hapettava stressi
   • Virtsan iso-PGF2-alfa

3. Keskitason fenotyypit

   • Kaulavaltimon intima-media paksuus (IMT) (vain lähtötasolla)
   • Endoteelitoiminto (virtausvälitteinen vasodilataatio) (FMD)
   • Valtimon jäykkyys (pulssiaallon nopeus) (PWV)

Kokeellinen protokolla Koehenkilöt saapuvat Veronan kaupungin sairaalan endokrinologian ja aineenvaihduntasairauksien osastolle klo 8.00 yön paaston jälkeen. Paino, pituus, vyötärön ympärysmitta ja verenpaine mitataan. Koehenkilöt makaavat koko tutkimuksen ajan sängyssä hiljaisessa, lämpötilasäädellyssä (22 °C) huoneessa. Teflon-laskimokatetri asetetaan kyynärpäälaskimoon verinäytteitä varten, ja se säilytetään normaalilla hitaasti tiputetulla suolaliuosinfuusiolla. Perustilan katsotaan saavutetuksi vähintään 20 minuutin levon jälkeen sängyssä laskimopunktion jälkeen.

Koehenkilöt eivät saa olla käyttäneet lääkkeitä, joiden tiedetään häiritsevän verisuonten toimintaa vähintään 2 viikkoon, ja heitä pyydetään pidättymään kofeiinia sisältävistä juomista vähintään 24 tuntia ennen tutkimusta. Systolista verenpainetta, diastolista verenpainetta, keskimääräistä valtimopainetta ja sykettä seurataan aikavälein Cardiocap II:lla (Datex, Suomi) koko tutkimuksen ajan.

Kaulavaltimon ja reisiluun PWV määritetään Compliorilla (Colson, Garges les Genosse, Ranska). Kaulavaltimon IMT arvioidaan korkean resoluution US Color-doppler-skannauksella. Sitten ei-dominantin yhteisen reisivaltimon virtausvälitteinen endoteeliriippuvainen verisuonten laajeneminen arvioidaan korkearesoluutioisella echo-dopplerilla (Esaote Biomedica AU6, Genova, Italia) 10 MHz:n lineaarisella vaskulaarisella koettimella, jonka aksiaalinen resoluutio on 0,01 mm. Perustason halkaisija ja veren virtausnopeus, leikkausjännityksen proksi, arvioidaan vähintään kolmena rinnakkaisena. Tämän jälkeen polven alle laitetaan verisuonimansetti ja painetaan 50 mmHg systolista verenpainetta korkeammaksi ja pidetään 5 minuuttia. Aluksen halkaisija ja virtausnopeus mitataan ajanhetkellä 0,5', 2', 4', 6' ja 8' mansetin tyhjentämisen jälkeen tutkijoiden vakiintuneen protokollan mukaisesti. Näissä olosuhteissa, kun mansetti tyhjennetään, kudoksissa, jotka ovat distaalisesti verenpainemansetista, esiintyy kemian jälkeistä hyperemiaa. Tämä hyperemia lisää veren virtausnopeutta yhteisessä reisivaltimossa, joka sijaitsee mansetin läheisyydessä. Virtausnopeuden lisääntyminen ja sitä seuraava leikkausjännityksen lisääntyminen saavat aikaan endoteelistä riippuvan verisuonten laajenemisen. On osoitettu, että tämä laajentuminen on NO-riippuvaista. Virtauksesta riippuvaisen verisuonten laajenemisen globaali kvantitatiivinen indeksi saadaan laskemalla verisuonen halkaisijan muutoskäyrän alla oleva pinta-ala ajan funktiona (8 minuutin havainnointi), joka ilmaistaan ​​sekä absoluuttisina arvoina että prosentuaalisina muutoksina verisuonen perushalkaisijasta. . Tutkijoiden käsissä tämän tekniikan päivien välinen vaihtelukerroin (n=15, kattaa laajan verisuonivasteen alueen) on 23,0±3,8 %. Endoteelista riippumatonta verisuonten laajenemista ei arvioida, koska paikallinen institutionaalinen eettinen komitea pitää glyseryylitrinitraatin antamista tutkimustarkoituksiin eettisesti perusteettomana lapsille.

Tutkijoiden nykyisen kokemuksen mukaan (n = 42 vakavasti lihavia lasta) keskimääräinen suu- ja sorkkatauti on yön yli paaston jälkeen 1,40 ± 0,91 % 8 minuuttia kohden (keskiarvo ± SD), mikä jättää huomattavasti tilaa dynaamisille muutoksille. Näillä vakavasti lihavilla lapsilla nämä tutkijat eivät löytäneet korrelaatiota suu- ja sorkkataudin ja BMI:n välillä. Näissä paritutkimuksissa käytetään ad hoc -mekaanista US-anturin pidikettä, jonka tavoitteena on auttaa lisäämään tekniikan toistettavuutta. Lisäksi käytetään erityistä automaattista ääriviivan seurantatekniikkaa valtimon halkaisijan muutosten automaattista laskemista varten minimoimaan tämän menetelmän käyttäjäriippuvuus.

Perusverinäytteitä (-10 min ja 0') kerätään glukoosin, insuliinin, C-peptidin, standardin lipidiprofiilin (kokonaiskolesteroli, HDL-kolesteroli ja triglyseridit), hapettuneen LDL:n, adiponektiinin, leptiinin, C3:n, TNF:n mittaamiseksi. -alfa, IL-6, IL-10 ja CRP mikromenetelmillä verenhukan rajoittamiseksi. LDL- ja HDL-alafraktioiden mittaamiseksi otetaan erillinen näyte. Perusvirtsat kerätään mittaamaan iso-PGF2-alfaa, tuotetta, joka on johdettu ei-entsymaattisesta lipidiperoksidaatiosta, jota katalysoivat solukalvojen ja LDL-partikkelien hapen vapaat radikaalit (43).

Ajanhetkellä 0' koehenkilöt nauttivat nestemäisen seka-aterian (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc), jonka kaloripitoisuus (300 kcal/m2 kehon pinta-alaa kohti) ja koostumus (53,8 % hiilihydraatteja, 29,5 % lipidejä, 16,7 % proteiineja) tunnetaan. yli 10 minuuttia. Glukoosi, insuliini ja C-peptidi mitataan kohdissa +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' ja +300'. Normaalit lipidit ja PWV mitataan +60', +120', +180', +240' ja +300'. Adiponektiini, leptiini, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP sekä LDL- ja HDL-alafraktiot mitataan +180' ja +300'. Aikana +180' suu- ja sorkkataudin arviointi toistetaan. Ateriatestin lopussa virtsat kerätään 8-iso-PGF2-alfan arvioimiseksi.

Verinäytteet sentrifugoidaan nopeasti 1500 g:ssa +4 °C:ssa, plasma/seerumi kerätään ja säilytetään -80 °C:ssa. Virtsanäytteet säilytetään -80 °C:ssa. Kokonaisverenhukkaa pidetään alle 100 cc:ssa.

Analyyttiset menetelmät LDL/HDL-alafraktioiden arviointia ja virtsan PGF2alphaa lukuun ottamatta käytetään menetelmiä, jotka on erityisesti optimoitu käyttämään pieniä määriä plasmaa/seerumia verenhukan minimoimiseksi. Glukoosi mitataan sängyn vieressä Yellow Spring Glucose Analyzer -laitteella glukoosioksidaasimenetelmällä. C-peptidi ja insuliini mitataan talon sisäisillä ELISA-mikromenetelmillä. Kokonais- ja HDL-kolesteroli ja kokonaistriglyseridit arvioidaan tavallisilla sisäisillä entsymaattisilla mikromenetelmillä. Adiponektiini, leptiini, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP arvioidaan talon sisäisillä immunometrisilla mikromenetelmillä. 8-Iso-PGF2alpha määritetään immunometrisellä määrityksellä virtsasta erottamisen jälkeen.

LDL/HDL-alafraktiot mitataan prof. Alberto Zambon, Padovan yliopiston lääketieteellinen korkeakoulu. Lyhyesti sanottuna, kun ultrasentrifugiputkessa on luotu epäjatkuva suolatiheysgradientti, näytteet sentrifugoidaan nopeudella 65 000 rpm 90 minuuttia 10 °C:ssa Sorvall TV-865B pystyroottorissa. Sen jälkeen sentrifugiputken pohjalta kerätään 38 0,45 ml:n fraktiota. Kolesteroli mitataan kustakin fraktiosta. Suhteellinen vaahdotusnopeus (Rf), joka luonnehtii LDL-huipun kelluvuutta ja on LDL-koon/tiheyden mitta, saadaan jakamalla LDL-kolesterolin huipun sisältävä fraktioluku kerättyjen fraktioiden kokonaismäärällä.

Beetasolujen toiminnan arviointi

Beetasolujen toiminta arvioidaan analysoimalla glukoosi- ja C-peptidikäyrät seka-ateriatestin aikana useiden laboratorioiden ehdottaman yleisen strategian mukaisesti pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna insuliinin eritys on kolmen komponentin summa:

1. perus (postabsorptiivinen) insuliinin eritysnopeudet;
2. insuliinin eritys vasteena plasman glukoosin lisääntymisnopeuteen ("dynaaminen" tai "johdannainen" erityskomponentti);
3. insuliinin eritystä vasteena todellisiin glukoositasoihin, jotka ylittävät postabsorptiivisen glukoosipitoisuuden ("staattinen" tai "suhteellinen" erityskomponentti).

Täydellinen kuvaus mallinnusstrategiasta löytyy tutkijoiden aikaisemmista julkaisuista. Parametrit arvioidaan ottamalla käyttöön tämä minimaalinen C-peptidin erityksen malli SAAM 1.1.2:ssa ohjelmisto (SAAM Institute, Seattle, WA). Tuntemattomien parametrien numeeriset arvot arvioidaan käyttämällä epälineaarisia pienimmän neliösumman arvoja.

Painot valitaan optimaalisesti, eli ne ovat yhtä suuria kuin mittausvirheiden varianssin käänteisarvo, joiden oletetaan olevan additiivisia, korreloimattomia, nollakeskiarvolla ja vakiovariaatiokertoimella (CV) 8 %.

Tämä analyysi tarjoaa hormonaalisen skenaarion, jossa aterian jälkeiset aterogeneettiset prosessit tapahtuvat.

Tilastollinen analyysi Tiedot kootaan keskiarvoina ± SEM. Otoksen koko (n=20 kussakin ryhmässä) on valittu siten, että 80 %:n mahdollisuus saavuttaa tilastollinen merkitsevyys 20-40 %:n eroille (minimi havaittava ero vaihtelee tutkittavana olevan muuttujan mukaan). Yleistä estimointiyhtälömenettelyä (GEE) käytetään 2-suuntaisen ANOVA:n suorittamiseen toistuville mittauksille ja tarvittaessa kovariaattien säätämiseen. Gaussin jakauma testataan kaikissa muuttujissa, ja jos havaitaan tilastollisesti merkittäviä poikkeamia normaaleista, käytetään logaritmista (tai muuta) muuntamista. Korrelaatioita etsitään Spearmanin rankkorrelaatiokertoimella. Tilastollinen merkitsevyys ilmoitetaan arvolla p<0,05. Tilastolliset analyysit suoritetaan käyttämällä SPSS 12.0:aa (tai uudempaa) MacOS X:lle.

Tämän tutkimusprojektin tavoitteiden saavuttaminen:

1. laajentaa tietoa lasten liikalihavuuden, tulehduksen, insuliiniresistenssin ja verisuonten toimintahäiriöiden välisestä suhteesta;
2. selvittää, liittyykö aterian jälkeinen hyperlipemia, aterian jälkeinen tulehdus ja/tai aterian jälkeinen hapetusstressi ateroskleroosin keskivaiheisiin fenotyyppeihin lihavilla lapsilla/nuorilla;
3. luoda mahdollisia uusia tavoitteita liikalihavuuden komplikaatioiden ehkäisyyn lapsella/nuorella ja mahdollisesti osoittaa uusia työkaluja liikalihavuuteen liittyvien häiriöiden hoitoon.