Mecanismos de aterogénesis durante el tiempo posprandial en la obesidad infantil

Algunos de los esquemas anteriores de las relaciones entre la masa grasa aumentada y la resistencia a la insulina no se han probado experimentalmente en el hombre. Por ejemplo, la mayoría de las relaciones que se muestran en humanos entre las citoquinas y la sensibilidad a la insulina son observaciones correlacionales.

En el niño obeso, el hígado graso es bastante prevalente y está más relacionado que otros depósitos de grasa con la resistencia a la insulina, la dislipidemia, la hipertensión arterial y los niveles elevados de marcadores de inflamación. El cuadro completo, por lo tanto, es consistente con un impulso acelerado hacia la aterosclerosis en el niño/adolescente obeso. De hecho, varios informes han demostrado que se pueden detectar fenotipos intermedios de aterosclerosis en el niño obeso. Además, se cree que la fase posprandial desempeña un papel propio en la aterogénesis.

Los investigadores plantean la hipótesis de que en los niños obesos resistentes a la insulina, los mecanismos de aterogénesis, como la hiperlipemia, el estrés oxidativo y la subinflamación, se activan en la fase posprandial, lo que da como resultado alteraciones de la función vascular.

Parámetros en estudio:

1. Agentes desencadenantes candidatos

   • Glucosa posprandial
   • Hiperlipemia posprandial
   • LDL pequeña y densa posprandial
   • Insulina posprandial
   • Mecanismos candidatos
   • Activación del complemento
   • C3

2. Inflamación

   • TNF-alfa
   • Interleucina-6 (IL-6)
   • Interleucina-10 (IL-10)
   • Proteína C reactiva (PCR)
   • Estrés oxidante
   • Iso-PGF2-alfa urinario

3. Fenotipos intermedios

   • Grosor íntima-media de la arteria carótida (IMT) (solo al inicio)
   • Función endotelial (vasodilatación mediada por flujo) (FMD)
   • Rigidez arterial (velocidad de onda de pulso) (PWV)

Protocolo experimental Los sujetos llegarán a la División de Endocrinología y Enfermedades Metabólicas del Hospital de la Ciudad de Verona a las 0800 h después de una noche en ayunas. Se medirá el peso, la altura, la circunferencia de la cintura y la presión arterial. Durante todo el estudio, los sujetos estarán acostados en una cama en una habitación tranquila con temperatura controlada (22 °C). Se insertará un catéter venoso de teflón en una vena antecubital para tomar muestras de sangre y se mantendrá permeable con una infusión de goteo lento de solución salina normal. El estado basal se considerará alcanzado tras al menos 20 minutos de reposo en cama tras la punción venosa.

Los sujetos no deben haber tomado medicamentos que interfieran con la función vascular durante al menos 2 semanas y se les pedirá que se abstengan de tomar bebidas que contengan cafeína durante al menos 24 horas antes del estudio. La presión arterial sistólica, la presión arterial diastólica, la presión arterial media y la frecuencia cardíaca se controlarán a intervalos de tiempo con Cardiocap II (Datex, Finlandia) durante todo el estudio.

La VOP carotídeo-femoral se evaluará mediante Complior (Colson, Garges les Genosse, Francia). El IMT de la arteria carótida se evaluará mediante ecografía doppler color de alta resolución. A continuación, se evaluará la vasodilatación dependiente del endotelio mediada por flujo de la arteria femoral común no dominante mediante eco-doppler de alta resolución (Esaote Biomedica AU6, Génova, Italia), con una sonda vascular lineal de 10 MHz con una resolución axial de 0,01 mm. El diámetro de referencia y la velocidad del flujo sanguíneo, un indicador del esfuerzo cortante, se evaluarán al menos por triplicado. Después de esto, se colocará un manguito esfigmomanométrico debajo de la rodilla y se inflará 50 mm Hg por encima de la presión arterial sistólica y se mantendrá durante 5 minutos. El diámetro del vaso y la velocidad del flujo se medirán a los 0,5', 2', 4', 6' y 8' después de desinflar el manguito, de acuerdo con el protocolo bien establecido de los investigadores. En estas condiciones, cuando se desinfla el manguito se producirá una hiperemia postisquémica en los tejidos distales al manguito esfigmomanométrico. Esta hiperemia inducirá un aumento en la velocidad del flujo sanguíneo de la arteria femoral común, que se encuentra próxima al manguito. El aumento de la velocidad del flujo y el consiguiente aumento de la tensión de cizallamiento provocan una vasodilatación dependiente del endotelio. Se ha demostrado que esta dilatación depende del NO. Se obtendrá un índice cuantitativo global de vasodilatación dependiente del flujo calculando el área bajo la curva de cambio en el diámetro del vaso en función del tiempo (8 min de observación), expresado como valores absolutos y como cambios porcentuales sobre el diámetro del vaso de referencia. . En manos de los investigadores, el coeficiente de variación entre días de esta técnica (n=15, que cubre un amplio rango de respuesta vascular) es 23,0±3,8%. La vasodilatación independiente del endotelio no se evaluará porque el Comité Ético Institucional local considera éticamente injustificable la administración de trinitrato de glicerilo con fines de investigación en niños.

En la experiencia actual de los investigadores (n = 42 niños con obesidad severa), el promedio de FMD después de un ayuno nocturno es de 1,40 ± 0,91 %. por 8 minutos (media ± SD), dejando así un espacio sustancial para mostrar cambios dinámicos. En estos niños severamente obesos, estos investigadores no encontraron correlación entre la FMD y el IMC. Se empleará un soporte de sonda US mecánico ad hoc en los presentes estudios emparejados, con el objetivo de ayudar a aumentar la reproducibilidad de la técnica. Además, se utilizará una técnica específica de seguimiento de contorno automático para el cálculo automático de los cambios en el diámetro arterial para minimizar la dependencia del operador de este método.

Se recolectarán muestras de sangre de referencia (-10 min y 0') para medir glucosa, insulina, péptido C, perfil de lípidos estándar (colesterol total, colesterol HDL y triglicéridos), LDL oxidado, adiponectina, leptina, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 y CRP por micrométodos para limitar la pérdida de sangre. Se recolectará una muestra separada para medir las subfracciones de LDL y HDL. Se recolectarán orinas de referencia para medir iso-PGF2-alfa, un producto derivado de la peroxidación lipídica no enzimática, catalizada por radicales libres de oxígeno en las membranas celulares y partículas LDL (43).

En el tiempo 0', los sujetos ingerirán una comida líquida mixta (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) de contenido calórico conocido (300 kcal por m2 de superficie corporal) y composición (53,8 % carbohidratos, 29,5 % lípidos, 16,7 % proteínas) más de 10 minutos. La glucosa, la insulina y el péptido C se medirán a +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' y +300'. Los lípidos estándar y PWV se medirán a +60', +120', +180', +240' y +300'. Las subfracciones de adiponectina, leptina, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, PCR y LDL y HDL se medirán a +180' y +300'. En el tiempo +180' se repetirá la evaluación de la fiebre aftosa. Al final de la prueba de comida, se recolectarán orinas para evaluar 8-iso-PGF2-alfa.

Las muestras de sangre se centrifugarán rápidamente a 1500 g a +4 °C, el plasma/suero se recolectarán y almacenarán a -80 °C. Las muestras de orina se almacenarán a -80 °C. La pérdida total de sangre se mantendrá por debajo de 100 cc.

Métodos analíticos Excepto para la evaluación de la subfracción LDL/HDL y la PGF2alfa en orina, se utilizarán métodos específicamente optimizados para usar pequeñas cantidades de plasma/suero para minimizar la pérdida de sangre. La glucosa se medirá junto a la cama con un analizador de glucosa Yellow Spring mediante el método de glucosa oxidasa. El péptido C y la insulina se medirán mediante micrométodos ELISA internos. El colesterol total y HDL y los triglicéridos totales se evaluarán mediante micrométodos enzimáticos internos estándar. Adiponectina, leptina, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, PCR se evaluarán mediante micrométodos inmunométricos internos. 8-Iso-PGF2alpha se evaluará mediante un ensayo inmunométrico después de la extracción de la orina.

Las subfracciones LDL/HDL se medirán en el laboratorio del prof. Alberto Zambon, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Padua. Brevemente, después de crear un gradiente de densidad de sal discontinuo en un tubo de ultracentrífuga, las muestras se centrifugarán a 65 000 rpm durante 90 min a 10 °C en un rotor vertical Sorvall TV-865B. A continuación, se recogen del fondo del tubo de centrífuga treinta y ocho fracciones de 0,45 ml. El colesterol se mide en cada fracción. La tasa de flotación relativa (Rf), que caracteriza la flotabilidad máxima de LDL y es una medida del tamaño/densidad de LDL, se obtiene dividiendo el número de fracción que contiene el pico de colesterol LDL por el número total de fracciones recolectadas.

Evaluación de la función de las células beta

La función de las células beta se evaluará mediante el análisis de las curvas de glucosa y péptido C durante la prueba de comida mixta, según la estrategia general propuesta por varios laboratorios con algunas ligeras modificaciones. Brevemente, la secreción de insulina es la suma de tres componentes:

1. tasas de secreción de insulina basal (postabsorción);
2. secreción de insulina en respuesta a la velocidad de aumento de la glucosa en plasma (componente de secreción "dinámico" o "derivado");
3. secreción de insulina en respuesta a los niveles reales de glucosa por encima de la concentración de glucosa postabsorción (componente de secreción "estático" o "proporcional").

Se puede encontrar una descripción completa de la estrategia de modelado en publicaciones anteriores de los investigadores. Se estimarán parámetros implementando este modelo mínimo de secreción de péptido C en el SAAM 1.1.2 software (Instituto SAAM, Seattle, WA). Los valores numéricos de los parámetros desconocidos se estimarán utilizando mínimos cuadrados no lineales.

Los pesos se eligen de manera óptima, es decir, iguales a la inversa de la varianza de los errores de medición, que se supone que son aditivos, no correlacionados, con media cero y un coeficiente de variación (CV) constante del 8%.

Este análisis proporcionará el escenario hormonal en el que tienen lugar los procesos aterogénicos posprandiales.

Análisis estadístico Los datos se resumirán como medios ± SEM. El tamaño de la muestra (n=20 en cada grupo) ha sido seleccionado con el objetivo de tener un 80% de probabilidad de alcanzar significación estadística para diferencias del 20-40% (la diferencia mínima detectable varía de una variable a otra en estudio). El procedimiento de ecuación de estimación general (GEE) se utilizará para ejecutar ANOVA de 2 vías para medidas repetidas y para ajustar las covariables, si es necesario. Se probará la distribución gaussiana en todas las variables y, si se encuentran desviaciones estadísticamente significativas de la normalidad, se aplicará una transformación logarítmica (u otra). Las correlaciones se buscarán mediante el coeficiente de correlación de rangos de Spearman. La significación estadística se declarará en p<0,05. Los análisis estadísticos se realizarán con SPSS 12.0 (o superior) para MacOS X.

Alcanzar los objetivos del presente proyecto de investigación permitirá:

1. ampliar el conocimiento sobre la relación entre obesidad infantil, inflamación, resistencia a la insulina y disfunción vascular;
2. dilucidar si la hiperlipemia posprandial, la inflamación posprandial y/o el estrés oxidativo posprandial están asociados a fenotipos intermedios de aterosclerosis en el niño/adolescente obeso;
3. establecer nuevos objetivos potenciales para la prevención de las complicaciones de la obesidad en el niño/adolescente y potencialmente indicar nuevas herramientas para el tratamiento de los trastornos asociados a la obesidad.