Mecanismos de aterogênese durante o período pós-prandial na obesidade infantil

Alguns dos esboços anteriores das relações entre o aumento da massa gorda e a resistência à insulina não foram comprovados experimentalmente no homem. Por exemplo, a maioria das relações mostradas em humanos entre citocinas e sensibilidade à insulina são observações correlacionais.

Na criança obesa, o fígado gorduroso é bastante prevalente e está mais intimamente associado do que outros depósitos de gordura à resistência à insulina, dislipidemia, hipertensão arterial e a níveis elevados de marcadores de inflamação. O quadro completo, portanto, é consistente com um impulso acelerado para a aterosclerose na criança/adolescente obeso. De fato, vários relatos demonstraram que fenótipos intermediários de aterosclerose podem ser detectados na criança obesa. Além disso, acredita-se que a fase pós-prandial desempenhe um papel próprio na aterogênese.

Os investigadores levantam a hipótese de que, na criança obesa resistente à insulina, os mecanismos de aterogênese, como hiperlipemia, estresse oxidativo e sub-inflamação, são ativados na fase pós-prandial, resultando em comprometimento da função vascular.

Parâmetros em estudo:

1. Agentes desencadeadores candidatos

   • Glicose pós-prandial
   • Hiperlipidemia pós-prandial
   • LDL pós-prandial pequeno e denso
   • Insulina pós-prandial
   • Mecanismos candidatos
   • ativação do complemento
   • C3

2. Inflamação

   • TNF-alfa
   • Interleucina-6 (IL-6)
   • Interleucina-10 (IL-10)
   • Proteína C reativa (PCR)
   • Estresse Oxidante
   • Iso-PGF2-alfa urinário

3. Fenótipos Intermediários

   • Espessura média-intimal da artéria carótida (IMT) (somente na linha de base)
   • Função endotelial (vasodilatação mediada por fluxo) (FMD)
   • Rigidez Arterial (velocidade da onda de pulso) (PWV)

Protocolo experimental Os sujeitos chegarão à Divisão de Endocrinologia e Doenças Metabólicas do Hospital da Cidade de Verona às 08:00 h após um jejum noturno. Serão medidos peso, altura, circunferência da cintura e pressão arterial. Durante todo o estudo, os sujeitos estarão deitados na cama em uma sala silenciosa e com temperatura controlada (22°C). Um cateter venoso de Teflon será inserido em uma veia antecubital para coleta de sangue e será mantido patente com uma infusão de soro fisiológico normal de gotejamento lento. O estado basal será considerado atingido após pelo menos 20 minutos de repouso no leito após a punção venosa.

Os indivíduos não devem estar tomando nenhuma droga conhecida por interferir na função vascular por pelo menos 2 semanas e serão solicitados a abster-se de bebidas que contenham cafeína por pelo menos 24 horas antes do estudo. A pressão arterial sistólica, a pressão arterial diastólica, a pressão arterial média e a frequência cardíaca serão monitoradas em intervalos de tempo com Cardiocap II (Datex, Finlândia) ao longo do estudo.

A VOP carótida-femoral será avaliada com o Complior (Colson, Garges les Genosse, França). O EMI da artéria carótida será avaliado por US de alta resolução com Doppler colorido. Em seguida, a vasodilatação endotélio-dependente mediada por fluxo da artéria femoral comum não dominante será avaliada por eco-doppler de alta resolução (Esaote Biomedica AU6, Genova, Itália), com uma sonda vascular linear de 10 MHz com resolução axial de 0,01 mm. O diâmetro basal e a velocidade do fluxo sanguíneo, um indicador da tensão de cisalhamento, serão avaliados pelo menos em triplicado. Depois disso, um manguito esfigmomanométrico será colocado sob o joelho e inflado 50 mm Hg acima da pressão arterial sistólica e mantido por 5'. O diâmetro do vaso e a velocidade do fluxo serão medidos nos tempos 0,5', 2', 4', 6' e 8' após a desinsuflação do manguito, de acordo com o protocolo bem estabelecido dos investigadores. Nessas condições, quando o manguito é esvaziado, ocorre hiperemia pós-isquêmica nos tecidos distais ao manguito esfigmomanométrico. Essa hiperemia induzirá um aumento na velocidade do fluxo sanguíneo da artéria femoral comum, localizada proximalmente ao manguito. O aumento da velocidade do fluxo e o conseqüente aumento da tensão de cisalhamento provocam uma vasodilatação dependente do endotélio. Tem sido demonstrado que esta dilatação é NO-dependente. Um índice quantitativo global de vasodilatação fluxo-dependente será obtido pelo cálculo da área sob a curva de mudança no diâmetro do vaso em função do tempo (8 min de observação), expresso tanto como valores absolutos quanto como mudanças percentuais sobre o diâmetro basal do vaso . Nas mãos dos investigadores, o coeficiente de variação entre dias desta técnica (n=15, abrangendo uma ampla gama de resposta vascular) é de 23,0±3,8%. A vasodilatação independente do endotélio não será avaliada porque a administração de gliceril-trinitrato para fins de pesquisa é considerada eticamente injustificável em crianças pelo Comitê de Ética Institucional local.

Na experiência atual dos investigadores (n=42 crianças gravemente obesas), a FMD média após um jejum noturno é de 1,40±0,91%. por 8 minutos (média ± DP), deixando assim espaço substancial para mostrar mudanças dinâmicas. Nessas crianças gravemente obesas, esses investigadores não encontraram nenhuma correlação entre FMD e IMC. Um porta-sonda de US mecânico ad hoc será empregado nos presentes estudos pareados, com o objetivo de auxiliar no aumento da reprodutibilidade da técnica. Além disso, uma técnica específica de rastreamento automático de contorno para o cálculo automático das mudanças no diâmetro arterial será usada para minimizar a dependência do operador desse método.

Amostras de sangue basal (-10 min e 0') serão coletadas para medir glicose, insulina, peptídeo C, perfil lipídico padrão (colesterol total, HDL-colesterol e triglicerídeos), LDL-oxidado, adiponectina, leptina, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 e PCR por micrométodos para limitar a perda de sangue. Uma amostra separada será coletada para medir as subfrações de LDL e HDL. Urinas basais serão coletadas para medir iso-PGF2-alfa, um produto derivado da peroxidação lipídica não enzimática, catalisada por radicais livres de oxigênio nas membranas celulares e partículas de LDL (43).

No tempo 0', os sujeitos irão ingerir uma refeição líquida mista (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) de conteúdo calórico conhecido (300 kcal por m2 de área de superfície corporal) e composição (53,8% de carboidratos, 29,5% de lipídios, 16,7% de proteínas) mais de 10 minutos. Glicose, insulina e peptídeo C serão medidos em +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' e +300'. Os lipídios padrão e PWV serão medidos em +60', +120', +180', +240' e +300'. Adiponectina, leptina, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, PCR e subfrações de LDL e HDL serão medidos em +180' e +300'. No tempo +180', a avaliação da febre aftosa será repetida. Ao final da refeição serão coletadas amostras de urina para dosagem de 8-iso-PGF2-alfa.

As amostras de sangue serão rapidamente centrifugadas a 1500 g a +4 °C, o plasma/soro será coletado e armazenado a -80 ° C. As amostras de urina serão armazenadas a -80 ° C. A perda total de sangue será mantida abaixo de 100 cc.

Métodos analíticos Exceto para avaliação de subfração de LDL/HDL e PGF2alfa na urina, métodos especificamente otimizados para usar pequenas quantidades de plasma/soro serão usados ​​para minimizar a perda de sangue. A glicose será medida à beira do leito com um analisador de glicose Yellow Spring pelo método da glicose oxidase. O peptídeo C e a insulina serão medidos por micrométodos ELISA internos. O colesterol total e HDL e os triglicerídeos totais serão avaliados por micrométodos enzimáticos padronizados internos. Adiponectina, leptina, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, PCR serão avaliados por micrométodos imunométricos internos. O 8-Iso-PGF2alpha será avaliado por um ensaio imunométrico após extração de urina.

As subfrações de LDL/HDL serão dosadas no laboratório do prof. Alberto Zambon, da Escola de Medicina da Universidade de Pádua. Resumidamente, após criar um gradiente descontínuo de densidade de sal em um tubo de ultracentrífuga, as amostras serão centrifugadas a 65.000 rpm por 90 min a 10°C em um rotor vertical Sorvall TV-865B. Trinta e oito frações de 0,45 ml são então coletadas do fundo do tubo da centrífuga. O colesterol é medido em cada fração. A taxa de flutuação relativa (Rf), que caracteriza a flutuabilidade do pico do LDL e é uma medida do tamanho/densidade do LDL, é obtida dividindo o número da fração contendo o pico do colesterol LDL pelo número total de frações coletadas.

Avaliação da função das células beta

A função das células beta será avaliada pela análise das curvas de glicose e peptídeo C durante o teste de refeição mista, de acordo com a estratégia geral proposta por vários laboratórios com algumas pequenas modificações. Resumidamente, a secreção de insulina é a soma de três componentes:

1. taxas basais (pós-absortivas) de secreção de insulina;
2. secreção de insulina em resposta à taxa de aumento da glicose plasmática (componente de secreção "dinâmico" ou "derivado");
3. secreção de insulina em resposta aos níveis reais de glicose acima da concentração de glicose pós-absortiva (componente de secreção "estático" ou "proporcional").

Uma descrição completa da estratégia de modelagem pode ser encontrada nas publicações anteriores dos investigadores. Os parâmetros serão estimados implementando este modelo mínimo de secreção de peptídeo C no SAAM 1.1.2 software (SAAM Institute, Seattle, WA). Os valores numéricos dos parâmetros desconhecidos serão estimados usando mínimos quadrados não lineares.

Os pesos são escolhidos de forma ótima, ou seja, iguais ao inverso da variância dos erros de medição, que se supõe serem aditivos, não correlacionados, com média zero e coeficiente de variação (CV) constante de 8%.

Essa análise fornecerá o cenário hormonal em que ocorrem os processos aterogênicos pós-prandiais.

Análise estatística Os dados serão resumidos como médias±SEM. O tamanho da amostra (n=20 em cada grupo) foi selecionado com o objetivo de ter 80% de chance de atingir significância estatística para diferenças de 20-40% (a diferença mínima detectável varia de variável para variável em estudo). O procedimento de equação de estimativa geral (GEE) será usado para executar ANOVA de 2 vias para medidas repetidas e para ajustar para covariáveis, se necessário. A distribuição gaussiana será testada em todas as variáveis ​​e, se forem encontrados desvios estatisticamente significativos da normalidade, será aplicada a transformação logarítmica (ou outra). As correlações serão buscadas pelo coeficiente de correlação de postos de Spearman. A significância estatística será declarada em p<0,05. As análises estatísticas serão realizadas usando SPSS 12.0 (ou superior) para MacOS X.

Alcançar os objetivos do presente projeto de pesquisa irá:

1. ampliar o conhecimento sobre a relação entre obesidade infantil, inflamação, resistência à insulina e disfunção vascular;
2. elucidar se hiperlipemia pós-prandial, inflamação pós-prandial e/ou estresse oxidativo pós-prandial estão associados a fenótipos intermediários de aterosclerose na criança/adolescente obeso;
3. estabelecer novos alvos potenciais de prevenção de complicações da obesidade na criança/adolescente e potencialmente indicar novas ferramentas para o tratamento de distúrbios associados à obesidade.