Mechanismen der Atherogenese während der postprandialen Zeit bei Fettleibigkeit bei Kindern

Einige frühere Darstellungen der Zusammenhänge zwischen erhöhter Fettmasse und Insulinresistenz konnten beim Menschen experimentell nicht nachgewiesen werden. Beispielsweise handelt es sich bei den meisten beim Menschen gezeigten Zusammenhängen zwischen Zytokinen und der Insulinsensitivität um Korrelationsbeobachtungen.

Bei adipösen Kindern ist die Fettleber weit verbreitet und wird stärker als andere Fettdepots mit Insulinresistenz, Dyslipidämie, Bluthochdruck und hohen Werten von Entzündungsmarkern in Verbindung gebracht. Das Gesamtbild stimmt daher mit einer beschleunigten Tendenz zur Arteriosklerose bei adipösen Kindern/Jugendlichen überein. Tatsächlich haben mehrere Berichte gezeigt, dass bei adipösen Kindern intermediäre Phänotypen der Atherosklerose festgestellt werden können. Darüber hinaus wird angenommen, dass die postprandiale Phase eine eigene Rolle bei der Atherogenese spielt.

Die Forscher gehen davon aus, dass bei adipösen, insulinresistenten Kindern Mechanismen der Atherogenese, wie Hyperlipämie, oxidativer Stress und Subinflammation, in der postprandialen Phase aktiviert werden, was zu Beeinträchtigungen der Gefäßfunktion führt.

Untersuchte Parameter:

1. Mögliche auslösende Wirkstoffe

   • Postprandiale Glukose
   • Postprandiale Hyperlipämie
   • Postprandiales kleines, dichtes LDL
   • Postprandiales Insulin
   • Kandidatenmechanismen
   • Komplementaktivierung
   • C3

2. Entzündung

   • TNF-alpha
   • Interleukin-6 (IL-6)
   • Interleukin-10 (IL-10)
   • C-reaktives Protein (CRP)
   • Oxidativer Stress
   • Urin-Iso-PGF2-alpha

3. Zwischenphänotypen

   • Intima-Media-Dicke der Halsschlagader (IMT) (nur zu Studienbeginn)
   • Endothelfunktion (durchflussvermittelte Vasodilatation) (FMD)
   • Arterielle Steifheit (Pulswellengeschwindigkeit) (PWV)

Versuchsprotokoll Die Probanden werden um 08:00 Uhr nach einem Fasten über Nacht in der Abteilung für Endokrinologie und Stoffwechselkrankheiten des Stadtkrankenhauses von Verona eintreffen. Gewicht, Größe, Taillenumfang und Blutdruck werden gemessen. Während der gesamten Studie liegen die Probanden im Bett in einem ruhigen, temperierten Raum (22 °C). Zur Blutentnahme wird ein Teflon-Venenkatheter in eine Ellenbogenvene eingeführt und mit einer normalen, langsam tropfenden Infusion von Kochsalzlösung offen gehalten. Der Ausgangszustand gilt nach mindestens 20 Minuten Bettruhe nach der Venenpunktion als erreicht.

Die Probanden dürfen seit mindestens 2 Wochen keine Medikamente eingenommen haben, von denen bekannt ist, dass sie die Gefäßfunktion beeinträchtigen, und sie werden gebeten, vor der Studie mindestens 24 Stunden lang auf koffeinhaltige Getränke zu verzichten. Systolischer Blutdruck, diastolischer Blutdruck, mittlerer arterieller Druck und Herzfrequenz werden während der gesamten Studie in Zeitintervallen mit Cardiocap II (Datex, Finnland) überwacht.

Das karotis-femorale PWV wird mit Complior (Colson, Garges les Genosse, Frankreich) beurteilt. Die IMT der Halsschlagader wird durch einen hochauflösenden US-Farbdoppler-Scan beurteilt. Anschließend wird die flussvermittelte endothelabhängige Vasodilatation der nichtdominanten Arteria femoralis communis mittels hochauflösendem Echodoppler (Esaote Biomedica AU6, Genua, Italien) mit einer linearen 10-MHz-Gefäßsonde mit einer axialen Auflösung von 0,01 mm beurteilt. Der Grundliniendurchmesser und die Blutflussgeschwindigkeit, ein Indikator für die Scherspannung, werden mindestens dreifach bewertet. Danach wird eine Blutdruckmanschette unter das Knie gelegt und 50 mm Hg über dem systolischen Blutdruck aufgepumpt und 5 Minuten lang aufrechterhalten. Gefäßdurchmesser und Strömungsgeschwindigkeit werden zum Zeitpunkt 0,5', 2', 4', 6' und 8' nach dem Entleeren der Manschette gemäß dem bewährten Protokoll der Forscher gemessen. Unter diesen Bedingungen kommt es bei entleerter Manschette zu einer postischämischen Hyperämie in den Geweben, die distal zur Blutdruckmanschette liegen. Diese Hyperämie führt zu einem Anstieg der Blutflussgeschwindigkeit der Arteria femoralis communis, die sich proximal zur Manschette befindet. Die Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit und die daraus resultierende Erhöhung der Scherspannung lösen eine endothelabhängige Vasodilatation aus. Es wurde gezeigt, dass diese Dilatation NO-abhängig ist. Ein globaler quantitativer Index der flussabhängigen Vasodilatation wird durch Berechnung der Fläche unter der Kurve der Änderung des Gefäßdurchmessers als Funktion der Zeit (8 Minuten Beobachtungszeit) erhalten, ausgedrückt sowohl als absolute Werte als auch als prozentuale Änderungen gegenüber dem Basislinien-Gefäßdurchmesser . In den Händen der Forscher beträgt der Variationskoeffizient dieser Technik zwischen den Tagen (n=15, deckt einen weiten Bereich der Gefäßreaktion ab) 23,0 ± 3,8 %. Die endothelunabhängige Vasodilatation wird nicht bewertet, da die Verabreichung von Glyceryltrinitrat zu Forschungszwecken bei Kindern von der örtlichen institutionellen Ethikkommission als ethisch nicht vertretbar erachtet wird.

Nach den aktuellen Erfahrungen der Forscher (n = 42 stark fettleibige Kinder) beträgt die durchschnittliche MKS nach einer Fastennacht über Nacht 1,40 ± 0,91 %. pro 8 Minuten (Mittelwert ± SD), wodurch erheblicher Spielraum für die Darstellung dynamischer Änderungen bleibt. Bei diesen stark fettleibigen Kindern fanden diese Forscher keinen Zusammenhang zwischen MKS und BMI. In den vorliegenden gepaarten Studien wird ein Ad-hoc-mechanischer US-Sondenhalter eingesetzt, mit dem Ziel, die Reproduzierbarkeit der Technik zu verbessern. Darüber hinaus wird eine spezielle automatische Konturverfolgungstechnik zur automatischen Berechnung der Änderungen des Arteriendurchmessers verwendet, um die Bedienerabhängigkeit dieser Methode zu minimieren.

Zu Beginn (-10 Minuten und 0 Minuten) werden Blutproben entnommen, um Glukose, Insulin, C-Peptid, Standard-Lipidprofil (Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceride), oxidiertes LDL, Adiponektin, Leptin, C3, TNF zu messen -alpha, IL-6, IL-10 und CRP durch Mikromethoden, um den Blutverlust zu begrenzen. Zur Messung der LDL- und HDL-Subfraktionen wird eine separate Probe entnommen. Basisurin wird gesammelt, um Iso-PGF2-alpha zu messen, ein Produkt, das aus der nichtenzymatischen Lipidperoxidation stammt, die durch freie Sauerstoffradikale auf Zellmembranen und LDL-Partikeln katalysiert wird (43).

Zum Zeitpunkt 0‘ nehmen die Probanden eine gemischte flüssige Mahlzeit (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) mit bekanntem Kaloriengehalt (300 kcal pro m2 Körperoberfläche) und bekannter Zusammensetzung (53,8 % Kohlenhydrate, 29,5 % Lipide, 16,7 % Proteine) zu sich. über 10 Minuten. Glukose, Insulin und C-Peptid werden bei +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' gemessen. und +300'. Standardlipide und PWV werden bei +60', +120', +180', +240' und +300' gemessen. Adiponektin, Leptin, C3, TNF-alpha, IL-6, IL-10, CRP sowie LDL- und HDL-Subfraktionen werden bei +180' und +300' gemessen. Zum Zeitpunkt +180' wird die MKS-Beurteilung wiederholt. Am Ende der Mahlzeit wird Urin gesammelt, um 8-iso-PGF2-alpha zu bestimmen.

Blutproben werden schnell bei 1500 g bei +4 °C zentrifugiert, Plasma/Serum wird gesammelt und bei -80 °C gelagert. Urinproben werden bei -80 °C gelagert. Der Gesamtblutverlust wird unter 100 cm³ gehalten.

Analysemethoden Mit Ausnahme der LDL/HDL-Subfraktionsbestimmung und Urin-PGF2alpha werden Methoden verwendet, die speziell für die Verwendung winziger Mengen Plasma/Serum optimiert sind, um den Blutverlust zu minimieren. Die Glukose wird am Krankenbett mit einem Yellow Spring Glucose Analyzer nach der Glukoseoxidase-Methode gemessen. C-Peptid und Insulin werden mit hauseigenen ELISA-Mikromethoden gemessen. Gesamt- und HDL-Cholesterin sowie Gesamttriglyceride werden mit standardmäßigen hauseigenen enzymatischen Mikromethoden bestimmt. Adiponektin, Leptin, C3, TNF-alpha, IL-6, IL-10 und CRP werden durch interne immunometrische Mikromethoden bewertet. 8-Iso-PGF2alpha wird durch einen immunometrischen Test nach der Extraktion aus dem Urin bestimmt.

LDL/HDL-Subfraktionen werden im Labor von Prof. Dr. Alberto Zambon, an der Medizinischen Fakultät der Universität Padua. Kurz gesagt: Nach der Erzeugung eines diskontinuierlichen Salzdichtegradienten in einem Ultrazentrifugenröhrchen werden die Proben 90 Minuten lang bei 65.000 U/min und 10 °C in einem Sorvall TV-865B-Vertikalrotor zentrifugiert. Anschließend werden 38 0,45-ml-Fraktionen vom Boden des Zentrifugenröhrchens gesammelt. Cholesterin wird in jeder Fraktion gemessen. Die relative Flotationsrate (Rf), die den LDL-Peak-Auftrieb charakterisiert und ein Maß für die LDL-Größe/-Dichte ist, wird durch Division der Fraktionsanzahl, die den LDL-Cholesterin-Peak enthält, durch die Gesamtzahl der gesammelten Fraktionen erhalten.

Beurteilung der Betazellfunktion

Die Betazellfunktion wird durch Analyse der Glukose- und C-Peptidkurven während des Tests mit gemischten Mahlzeiten gemäß der von mehreren Labors vorgeschlagenen allgemeinen Strategie mit einigen geringfügigen Änderungen bewertet. Kurz gesagt ist die Insulinsekretion die Summe aus drei Komponenten:

1. basale (postabsorptive) Insulinsekretionsraten;
2. Insulinsekretion als Reaktion auf die Anstiegsrate der Plasmaglukose („dynamische“ oder „derivative“ Sekretionskomponente);
3. Insulinsekretion als Reaktion auf den tatsächlichen Glukosespiegel über der postabsorptiven Glukosekonzentration („statische“ oder „proportionale“ Sekretionskomponente).

Eine vollständige Beschreibung der Modellierungsstrategie finden Sie in früheren Veröffentlichungen der Forscher. Die Parameter werden durch Implementierung dieses Minimalmodells der C-Peptid-Sekretion im SAAM 1.1.2 geschätzt Software (SAAM Institute, Seattle, WA). Numerische Werte der unbekannten Parameter werden mithilfe nichtlinearer kleinster Quadrate geschätzt.

Die Gewichte werden optimal gewählt, d. h. gleich dem Kehrwert der Varianz der Messfehler, die als additiv, unkorreliert, mit einem Mittelwert von Null und einem konstanten Variationskoeffizienten (CV) von 8 % angenommen werden.

Diese Analyse liefert das hormonelle Szenario, in dem die postprandialen atherogenetischen Prozesse stattfinden.

Statistische Analyse Die Daten werden als Mittelwert ± SEM zusammengefasst. Die Größe der Stichprobe (n=20 in jeder Gruppe) wurde mit dem Ziel ausgewählt, eine 80-prozentige Chance zu haben, eine statistische Signifikanz für Unterschiede von 20–40 % zu erreichen (der minimal erkennbare Unterschied variiert von Variable zu untersuchter Variable). Das allgemeine Schätzgleichungsverfahren (GEE) wird verwendet, um eine 2-Wege-ANOVA für wiederholte Messungen durchzuführen und bei Bedarf Anpassungen an Kovariaten vorzunehmen. Die Gaußsche Verteilung wird in allen Variablen getestet, und wenn statistisch signifikante Abweichungen von der Normalität festgestellt werden, wird eine logarithmische (oder andere) Transformation angewendet. Korrelationen werden anhand des Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman gesucht. Die statistische Signifikanz wird bei p<0,05 angegeben. Statistische Analysen werden mit SPSS 12.0 (oder höher) für MacOS X durchgeführt.

Um die Ziele des vorliegenden Forschungsprojekts zu erreichen, werden:

1. das Wissen über den Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit bei Kindern, Entzündungen, Insulinresistenz und Gefäßdysfunktion erweitern;
2. klären, ob postprandiale Hyperlipämie, postprandiale Entzündung und/oder postprandialer oxidativer Stress mit intermediären Phänotypen der Atherosklerose bei adipösen Kindern/Jugendlichen verbunden sind;
3. mögliche neue Ziele zur Prävention von Adipositas-Komplikationen bei Kindern/Jugendlichen festlegen und möglicherweise neue Instrumente für die Behandlung von Adipositas-bedingten Störungen aufzeigen.