Mekanismer for aterogenese under postprandial tid i fedme hos barn

Noen av tidligere skisser av forholdet mellom forstørret fettmasse og insulinresistens har ikke blitt bevist eksperimentelt hos mennesker. For eksempel er de fleste sammenhengene vist hos mennesker mellom cytokiner og insulinfølsomhet korrelasjonsobservasjoner.

Hos det overvektige barnet er fettlever ganske utbredt og er mer knyttet enn andre fettdepoter til insulinresistens, dyslipidemi, høyt blodtrykk og høye nivåer av betennelsesmarkører. Hele bildet stemmer derfor overens med en akselerert drift til åreforkalkning hos det overvektige barnet/ungdommen. Faktisk har flere rapporter vist at mellomliggende fenotyper av aterosklerose kan oppdages hos overvektige barn. Videre antas den post-prandiale fasen å spille en egen rolle i aterogenese.

Etterforskerne antar at hos overvektige insulinresistente barn aktiveres mekanismer for aterogenese, som hyperlipemi, oksidant-stress og subbetennelse, i den post-prandiale fasen, noe som resulterer i svekkelser av vaskulær funksjon.

Parametere som studeres:

1. Kandidatutløsende agenter

   • Post-prandial glukose
   • Postprandial hyperlipemi
   • Post-prandial liten tett LDL
   • Post-prandial insulin
   • Kandidatmekanismer
   • Komplementaktivering
   • C3

2. Betennelse

   • TNF-alfa
   • Interleukin-6 (IL-6)
   • Interleukin-10 (IL-10)
   • C-reaktivt protein (CRP)
   • Oksiderende stress
   • Urin-iso-PGF2-alfa

3. Mellomliggende fenotyper

   • Carotis artery intima-media thickness (IMT) (kun ved baseline)
   • Endotelfunksjon (strømmediert vasodilatasjon) (FMD)
   • Arteriell stivhet (pulsbølgehastighet) (PWV)

Eksperimentell protokoll Forsøkspersonene vil ankomme avdelingen for endokrinologi og metabolske sykdommer ved Verona City Hospital kl. 0800 etter faste over natten. Vekt, høyde, midjeomkrets og blodtrykk vil bli målt. Under hele studiet vil forsøkspersonene ligge i sengen i et stille, temperaturkontrollert (22 °C) rom. Et Teflon venekateter vil bli satt inn i en antecubital vene for blodprøvetaking og vil holdes åpent med en vanlig saltvannsinfusjon med sakte drypp. Utgangstilstand vil bli ansett som oppnådd etter minst 20 minutters hvile i sengen etter venepunktur.

Forsøkspersonene må ikke ha brukt noen legemidler som er kjent for å forstyrre vaskulær funksjon i minst 2 uker og vil bli bedt om å avstå fra koffeinholdige drikker i minst 24 timer før studien. Systolisk blodtrykk, diastolisk blodtrykk, gjennomsnittlig arterielt trykk og hjertefrekvens vil bli overvåket med tidsintervaller med Cardiocap II (Datex, Finland) gjennom hele studien.

Carotis-femoral PWV vil bli vurdert ved hjelp av Complior (Colson, Garges les Genosse, Frankrike) . Carotis arterie IMT vil bli vurdert ved høyoppløselig amerikansk farge-doppler-skanning. Deretter vil strømningsmediert endotelavhengig vasodilatasjon av den ikke-dominante felles femorale arterie bli vurdert ved høyoppløselig ekko-doppler (Esaote Biomedica AU6, Genova, Italia), med en 10 MHz lineær vaskulær probe med aksial oppløsning på 0,01 mm. Grunnlinjediameter og blodstrømningshastighet, en proxy for skjærspenning, vil bli vurdert i det minste i tre eksemplarer. Etter dette vil en sfygmomanometrisk mansjett legges under kneet og blåses opp 50 mm Hg høyere enn systolisk blodtrykk og opprettholdes i 5'. Kardiameter og strømningshastighet vil bli målt til tiden 0,5', 2', 4', 6' og 8' etter at mansjetten er tømt, i henhold til etterforskernes veletablerte protokoll. Under disse forholdene, når mansjetten er tømt, vil postiskemisk hyperemi finne sted i vevet som er distalt for den sfygmomanometriske mansjetten. Denne hyperemien vil indusere en økning i blodstrømningshastigheten til den vanlige lårarterien, som er lokalisert proksimalt til mansjetten. Økningen i strømningshastighet, og den påfølgende økningen i skjærspenning, fremkaller en endotelavhengig vasodilatasjon. Det er vist at denne utvidelsen er NO-avhengig. En global kvantitativ indeks for strømningsavhengig vasodilatasjon vil bli oppnådd ved å beregne arealet under kurven for endring i kardiameter som en funksjon av tid (8 minutter med observasjon), uttrykt både som absolutte verdier og som prosentvise endringer over kardiameterens grunnlinje . I etterforskernes hender er variasjonskoeffisienten mellom dag for denne teknikken (n=15, som dekker et bredt spekter av vaskulær respons) 23,0±3,8 %. Endotel-uavhengig vasodilatasjon vil ikke bli evaluert fordi administrering av glyseyltrinitrat for forskningsformål anses som etisk uforsvarlig hos barn av den lokale institusjonelle etiske komiteen.

I etterforskernes nåværende erfaring (n=42 alvorlig overvektige barn), er gjennomsnittlig MKS etter faste over natten 1,40±0,91 % per 8 minutter (gjennomsnitt±SD), og gir dermed betydelig plass til å vise dynamiske endringer. Hos disse alvorlig overvektige barna fant disse etterforskerne ingen sammenheng mellom FMD og BMI. En ad hoc mekanisk amerikansk sondeholder vil bli ansatt i de nåværende parede studiene, med mål om å øke reproduserbarheten av teknikken. Videre vil en spesifikk automatisk kontursporingsteknikk for automatisk beregning av endringene i arteriell diameter bli brukt for å minimere operatørens avhengighet av denne metoden.

Baseline (-10 min og 0') blodprøver vil bli samlet inn for å måle glukose, insulin, C-peptid, standard lipidprofil (totalkolesterol, HDL-kolesterol og triglyserider), oksidert-LDL, adiponectin, leptin, C3, TNF -alfa, IL-6, IL-10 og CRP ved mikrometoder for å begrense blodtap. En egen prøve vil bli samlet inn for å måle LDL- og HDL-underfraksjoner. Baseline-uriner vil bli samlet for å måle iso-PGF2-alfa, et produkt avledet fra ikke-enzymatisk lipidperoksidasjon, katalysert av frie oksygenradikaler på cellemembraner og LDL-partikler (43).

Ved tidspunkt 0' vil forsøkspersonene innta et blandet flytende måltid (Ensure Plus, 1,5 kcal/cc) med kjent kaloriinnhold (300 kcal per m2 kroppsoverflate) og sammensetning (53,8 % karbohydrater, 29,5 % lipider, 16,7 % proteiner) over 10 minutter. Glukose, insulin og C-peptid vil bli målt ved +15', +30', +45', +60', +90', +120', +150', +180', +210', +240' og +300'. Standard lipider og PWV vil bli målt ved +60', +120', +180', +240' og +300'. Adiponectin, leptin, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP og LDL og HDL subfraksjoner vil bli målt ved +180' og +300'. På tidspunktet vil +180' vurdering av FMD bli gjentatt. På slutten av måltidstesten vil urin bli samlet for å vurdere 8-iso-PGF2-alfa.

Blodprøver vil raskt bli sentrifugert ved 1500 g ved +4 °C, plasma/serum vil bli samlet og lagret ved -80 °C. Urinprøver lagres ved -80 °C. Totalt blodtap vil holdes under 100 cc.

Analysemetoder Bortsett fra vurdering av LDL/HDL-subfraksjoner og urin PGF2alpha, vil metoder som er spesifikt optimalisert for å bruke små mengder plasma/serum bli brukt for å minimere blodtap. Glukose vil bli målt ved sengen med en Yellow Spring Glucose Analyzer ved hjelp av glukoseoksidasemetoden. C-peptid og insulin vil bli målt med interne ELISA-mikrometoder. Totalt og HDL-kolesterol og totale triglyserider vil bli vurdert ved hjelp av standard interne enzymatiske mikrometoder. Adiponectin, leptin, C3, TNF-alfa, IL-6, IL-10, CRP vil bli vurdert med interne immunometriske mikrometoder. 8-Iso-PGF2alpha vil bli vurdert ved en immunometrisk analyse etter ekstraksjon fra urin.

LDL/HDL-underfraksjoner vil bli målt i laboratoriet til prof. Alberto Zambon, ved University of Padua School of Medicine. Kort fortalt, etter å ha laget en diskontinuerlig salttetthetsgradient i et ultrasentrifugerør, vil prøvene sentrifugeres ved 65 000 rpm i 90 minutter ved 10 °C i en Sorvall TV-865B vertikal rotor. Trettiåtte 0,45 ml fraksjoner samles deretter fra bunnen av sentrifugerøret. Kolesterol måles i hver fraksjon. Den relative flotasjonshastigheten (Rf), som karakteriserer LDL-toppoppdrift og er et mål på LDL-størrelse/-tetthet, oppnås ved å dele fraksjonstallet som inneholder LDL-kolesteroltoppen med det totale antallet fraksjoner som samles inn.

Vurdering av beta-cellefunksjon

Beta-cellefunksjon vil bli evaluert ved å analysere glukose- og C-peptidkurvene under testen for blandet måltid, i henhold til den generelle strategien foreslått av flere laboratorier med noen små modifikasjoner. Kort fortalt er insulinsekresjon summen av tre komponenter:

1. basale (postabsorptive) insulinsekresjonshastigheter;
2. insulinsekresjon som respons på økningshastigheten i plasmaglukose ("dynamisk" eller "derivat" sekresjonskomponent);
3. insulinsekresjon som respons på de faktiske glukosenivåene over den postabsorptive glukosekonsentrasjonen ("statisk" eller "proporsjonal" sekresjonskomponent).

En fullstendig beskrivelse av modelleringsstrategien finnes i etterforskernes tidligere publikasjoner. Parametre vil bli estimert ved å implementere denne minimale modellen for C-peptidsekresjon i SAAM 1.1.2 programvare (SAAM Institute, Seattle, WA). Numeriske verdier av de ukjente parameterne vil bli estimert ved å bruke ikke-lineære minste kvadrater.

Vekter velges optimalt, dvs. lik inversen av variansen til målefeilene, som antas å være additive, ukorrelerte, med null gjennomsnitt og en konstant variasjonskoeffisient (CV) på 8 %.

Denne analysen vil gi det hormonelle scenariet der de postprandiale aterogenetiske prosessene finner sted.

Statistisk analyse Data vil bli oppsummert som gjennomsnitt±SEM. Størrelsen på utvalget (n=20 i hver gruppe) er valgt med mål om å ha 80 % sjanse for å oppnå statistisk signifikans for forskjeller på 20-40 % (minste påvisbare forskjell varierer fra variabel til variabel som studeres). Den generelle estimeringslikningsprosedyren (GEE) vil bli brukt til å kjøre 2-veis ANOVA for gjentatte mål og for å justere for kovariater, om nødvendig. Gaussisk fordeling vil bli testet i alle variabler, og hvis statistisk signifikante avvik fra normalitet blir funnet, vil logaritmisk (eller annen) transformasjon bli brukt. Korrelasjoner vil bli søkt etter Spearmans rangkorrelasjonskoeffisient. Statistisk signifikans vil bli erklært til p<0,05. Statistiske analyser vil bli utført med SPSS 12.0 (eller høyere) for MacOS X.

Å nå målene for dette forskningsprosjektet vil:

1. utvide kunnskapen om forholdet mellom fedme hos barn, betennelse, insulinresistens og vaskulær dysfunksjon;
2. klargjøre om postprandial hyperlipemi, postprandial betennelse og/eller postprandial oksidant stress er assosiert med mellomliggende fenotyper av aterosklerose hos overvektige barn/ungdom;
3. etablere potensielle nye mål for forebygging av fedmekomplikasjoner hos barnet/ungdommen og potensielt indikere nye verktøy for behandling av overvektsrelaterte forstyrrelser.