儿童肥胖餐后时间动脉粥样硬化形成的机制

早期关于脂肪量增大和胰岛素抵抗之间关系的一些概述尚未在人体实验中得到证实。 例如，人类细胞因子和胰岛素敏感性之间显示的大多数关系都是相关观察结果。

在肥胖儿童中，脂肪肝非常普遍，并且与胰岛素抵抗、血脂异常、高血压和高水平炎症标志物的相关性比其他脂肪库更密切。 因此，整个情况与肥胖儿童/青少年加速发展为动脉粥样硬化是一致的。 事实上，一些报告已经证明可以在肥胖儿童中检测到动脉粥样硬化的中间表型。 此外，餐后阶段被认为在动脉粥样硬化形成中发挥其自身的作用。

研究人员假设，在肥胖的胰岛素抵抗儿童中，动脉粥样硬化形成的机制，如高脂血症、氧化应激和亚炎症，在餐后阶段被激活，导致血管功能受损。

正在研究的参数：

1. 候选触发剂

   • 餐后血糖
   • 餐后高脂血症
   • 餐后低密度脂蛋白
   • 餐后胰岛素
   • 候选机制
   • 补体激活
   • C3

2. 炎

   • 肿瘤坏死因子-α
   • 白细胞介素 6 (IL-6)
   • 白细胞介素 10 (IL-10)
   • C反应蛋白（CRP）
   • 氧化应激
   • 尿异-PGF2-α

3. 中间表型

   • 颈动脉内膜中层厚度 (IMT)（仅在基线时）
   • 内皮功能（血流介导的血管舒张）（口蹄疫）
   • 动脉硬度（脉搏波速度）（PWV）

实验方案受试者将在禁食过夜后于 0800 点到达维罗纳市医院内分泌和代谢疾病科。 将测量体重、身高、腰围和血压。 在整个研究过程中，受试者将躺在一个安静、温度受控 (22 °C) 的房间的床上。 将特氟龙静脉导管插入肘前静脉进行血液采样，并通过生理盐水缓慢滴注保持通畅。 在静脉穿刺后至少在床上休息 20 分钟后，将被视为达到基线状态。

受试者必须在至少 2 周内未服用已知会干扰血管功能的药物，并且在研究前至少 24 小时内将被要求避免饮用含咖啡因的饮料。 在整个研究过程中，将使用 Cardiocap II（Datex，芬兰）按时间间隔监测收缩压、舒张压、平均动脉压和心率。

将使用 Complior (Colson, Garges les Genosse, France) 评估颈股动脉 PWV。 颈动脉 IMT 将通过高分辨率美国彩色多普勒扫描进行评估。 然后，将通过高分辨率回波多普勒（Esaote Biomedica AU6，热那亚，意大利），使用轴向分辨率为 0.01 毫米的 10 MHz 线性血管探头评估非优势股总动脉的流量介导的内皮依赖性血管舒张。 基线直径和血流速度（剪切应力的代表）将至少一式三份进行评估。 在此之后，将血压计袖带放在膝盖下并充气高于收缩压 50 毫米汞柱并维持 5 分钟。 根据研究人员完善的协议，容器直径和流速将在袖带放气后的 0.5'、2'、4'、6' 和 8' 时测量。 在这些条件下，当袖带放气时，将在血压计袖带远端的组织中发生缺血后充血。 这种充血会导致位于袖带近端的股总动脉的血流速度增加。 流速的增加和随之而来的剪切应力的增加引起内皮依赖性血管舒张。 已经表明，这种扩张是依赖于 NO 的。 通过计算血管直径变化曲线下的面积作为时间的函数（观察 8 分钟），将获得流量依赖性血管舒张的全局定量指数，以绝对值和相对于基线血管直径的百分比变化表示. 在研究人员手中，该技术（n=15，涵盖广泛的血管反应）的日间变异系数为 23.0±3.8%。 将不会评估不依赖内皮的血管舒张作用，因为当地机构伦理委员会认为出于研究目的而给予甘油三硝酸酯在儿童身上在伦理上是不合理的。

根据调查人员目前的经验（n=42 名严重肥胖儿童），隔夜禁食后的平均 FMD 为 1.40±0.91% 每 8 分钟一次（平均值±标准差），从而为显示动态变化留下很大的空间。 在这些严重肥胖的儿童中，这些研究人员发现 FMD 和 BMI 之间没有相关性。 在目前的配对研究中将使用一个特设的机械美国探头支架，目的是帮助提高该技术的可重复性。 此外，将使用一种用于自动计算动脉直径变化的特定自动轮廓跟踪技术，以最大限度地减少该方法对操作员的依赖性。

将收集基线（-10 分钟和 0'）血样以测量葡萄糖、胰岛素、C 肽、标准脂质谱（总胆固醇、HDL-胆固醇和甘油三酯）、氧化低密度脂蛋白、脂联素、瘦素、C3、TNF -alpha、IL-6、IL-10 和 CRP 通过微量方法限制失血。 将收集一个单独的样本来测量低密度脂蛋白和高密度脂蛋白亚组分。 将收集基线尿液以测量 iso-PGF2-alpha，这是一种源自非酶促脂质过氧化的产物，由细胞膜和 LDL 颗粒上的氧自由基催化 (43)。

在时间 0'，受试者将摄入已知热量含量（每平方米体表面积 300 kcal）和成分（53.8% 碳水化合物、29.5% 脂质、16.7% 蛋白质）的混合流质膳食（Ensure Plus，1.5 kcal/cc）超过 10 分钟。 葡萄糖、胰岛素和 C 肽将在 +15'、+30'、+45'、+60'、+90'、+120'、+150'、+180'、+210'、+240' 处测量和 +300'。 将在 +60'、+120'、+180'、+240' 和 +300' 测量标准脂质和 PWV。 脂联素、瘦素、C3、TNF-α、IL-6、IL-10、CRP 和 LDL 以及 HDL 亚组分将在 +180' 和 +300' 处测量。 在 +180' 时，将重复 FMD 评估。 在用餐结束时，将收集测试尿液以评估 8-iso-PGF2-alpha。

血液样本将在 +4 °C 下以 1500 g 快速离心，血浆/血清将被收集并储存在 -80° C。尿液样本将储存在 -80° C。总失血量将保持在 100 cc 以下。

分析方法 除了 LDL/HDL 亚组分评估和尿液 PGF2alpha，将使用专门优化以使用微量血浆/血清的方法来最大程度地减少失血。 将通过葡萄糖氧化酶法在床边使用 Yellow Spring 葡萄糖分析仪测量葡萄糖。 C 肽和胰岛素将通过内部 ELISA 微量方法进行测量。 总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇以及总甘油三酯将通过标准的内部酶促微量方法进行评估。 脂联素、瘦素、C3、TNF-α、IL-6、IL-10、CRP 将通过内部免疫微量方法进行评估。 8-Iso-PGF2alpha 将从尿液中提取后通过免疫测定法进行评估。

LDL/HDL 亚组分将在教授的实验室中测量。 帕多瓦大学医学院的 Alberto Zambon。 简而言之，在超速离心管中产生不连续的盐密度梯度后，样品将在 Sorvall TV-865B 垂直转子中以 65,000 rpm 的速度在 10°C 下离心 90 分钟。 然后从离心管底部收集三十八个 0.45 毫升的级分。 在每个分数中测量胆固醇。 相对浮选率 (Rf) 是低密度脂蛋白峰值浮力的特征, 是低密度脂蛋白大小/密度的量度, 是通过将包含低密度脂蛋白胆固醇峰值的分数除以收集到的分数总数获得的。

β细胞功能的评估

根据几个实验室提出的一般策略，稍作修改，将通过分析混合膳食测试期间的葡萄糖和 C 肽曲线来评估 β 细胞功能。 简而言之，胰岛素分泌是三个组成部分的总和：

1. 基础（吸收后）胰岛素分泌率；
2. 响应血浆葡萄糖增加率的胰岛素分泌（“动态”或“衍生”分泌成分）；
3. 胰岛素分泌响应高于吸收后葡萄糖浓度的实际葡萄糖水平（“静态”或“比例”分泌成分）。

可以在调查人员的早期出版物中找到对建模策略的完整描述。 将通过在 SAAM 1.1.2 中实施 C 肽分泌的最小模型来估计参数 软件（SAAM 研究所，华盛顿州西雅图）。 未知参数的数值将通过使用非线性最小二乘法来估计。

权重的选择是最优的，即等于测量误差方差的倒数，假设这些误差是加性的、不相关的、均值为零且变异系数 (CV) 为 8% 的常量。

该分析将提供发生餐后动脉粥样硬化过程的激素情景。

统计分析数据将总结为平均值±SEM。 选择样本大小（每组 n = 20）的目的是有 80% 的机会获得 20-40% 差异的统计显着性（最小可检测差异因研究中的变量而异）。 一般估计方程程序 (GEE) 将用于运行 2 向方差分析以进行重复测量，并在需要时针对协变量进行调整。 将在所有变量中测试高斯分布，如果发现统计上显着偏离正态性，将应用对数（或其他）变换。 将通过 Spearman 等级相关系数寻找相关性。 统计显着性将在 p<0.05 时声明。 将使用适用于 MacOS X 的 SPSS 12.0（或更高版本）进行统计分析。

实现本研究项目的目标将：

1. 扩大对儿童肥胖、炎症、胰岛素抵抗和血管功能障碍之间关系的认识；
2. 阐明餐后高脂血症、餐后炎症和/或餐后氧化应激是否与肥胖儿童/青少年的动脉粥样硬化中间表型相关；
3. 建立预防儿童/青少年肥胖并发症的潜在新目标，并可能指明治疗肥胖相关障碍的新工具。